胃癌患者血漿中miR-203a及其靶基因的表達差異與臨床意義

李媛華，羅華友，舒 若，龔方友，徐 玉，孫 亮△

(1.昆明醫科大學第一附屬醫院麻醉科，昆明 650032；2.昆明醫科大學第一附屬醫院胃腸外科，昆明 650032；3.云南省消化病研究所，昆明 650032；4.云南省消化道疾病防治工程技術研究中心，昆明 650032)

近年來，微小RNA (microRNA)在許多癌癥相關的研究報道中被證實，其參與了多種腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移等過程[1]。胃癌是世界范圍內病死率較高的惡性腫瘤之一，其發病機制尚不十分明確。近期研究表明微小RNA在胃癌的早期診斷、治療預后和生物靶標等方面可能存在潛在的臨床價值[1-3]。而miR-203a被報道在胃癌[4-6]、結直腸癌[7]、宮頸癌[8]、乳腺癌[9]、卵巢癌[10]、肝癌[11]、肺癌[12]、舌癌[13]、食管癌[14]、腎癌[15]和膀胱癌[16]等腫瘤的發生和發展過程中作為腫瘤抑制因子起調控作用。并且，新近研究還發現了一些miR-203a的新靶向基因，如E2F轉錄因子3(E2F3)[17-18]、毛細血管擴張性共濟失調癥突變基因(ATM)[7,19]和轉錄因子蝸牛同源物2(SNAI2)[4,20]等。由于前期研究多在癌細胞水平開展實驗[4,6,18,21]，其是否適合作為標志物或作用靶點等尚需更多的臨床試驗驗證。本研究比較分析miR-203a及其靶基因在胃癌患者和健康人群血漿中的表達差異，在胃癌患者手術前后血漿中的表達變化，及其與臨床病理的相關性，旨在為胃癌的臨床診斷和治療提供一些參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月至2014年12月在昆明醫科大學第一附屬醫院接受手術治療的胃癌患者120例作為試驗組，術前均未行放療或化療。同時選取120例健康體檢者作為對照組。試驗組患者的平均年齡為(58.21±8.74)歲，其中男65例，女55例。對照組的平均年齡為(56.02±7.95)歲，其中男58例，女62例。兩組人群的年齡和性別比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血漿采集及總RNA提取 靜脈采集手術前、手術后第7天的血液各2 mL，采集對照組血液2 mL。血液樣本快速轉入乙二胺四乙酸(EDTA)采血管，室溫靜置約30 min后，4 ℃下1 200 r/min離心10 min，轉移上清液至新的離心管。然后，4 ℃下1 200 r/min離心10 min，去除細胞成分，收集上層血漿至新的離心管。取200 μL血漿樣本，按GenEluteTMPlasma/Serum RNA Purification Mini Kit試劑盒(SIGMA-ALDRICH)的方法、步驟抽提血漿中的總RNA，利用熒光分光光度計(Thermo Fisher)測定血漿RNA濃度。提取的RNA置于-80 ℃保存備用。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測 參照Taq-Man miRNA Reverse Transcription試劑盒(Applied Bio Systems)的說明合成第一鏈cDNA。參照趙珊等[8]和曾玉等[10]在血漿中檢測miR-203的方法，設計了miR-203a的特異性引物序列，見表1。并且根據miR-203a在其他癌癥患者血漿中的表達水平選擇以U6小環RNA作為內參[12,18]。靶基因E2F3、ATM和SNAI2的引物序列見表1。參照之前的研究[17,19-20]報道，靶基因的表達量分析選擇以GAPDH作為內參。以上引物均由廣州銳博生物公司合成。利用SYBR Master Mix試劑盒(Toyobo)在ABI 7500實時熒光定量PCR儀(Applied BioSystems)上對上述合成的cDNA進行RT-qPCR檢測。每個反應重復3次。結果采用2-△△Ct相對定量法[22]計算。

表1 用于RT-qPCR檢測用的引物序列

1.2.3手術方法及術后隨訪 本試驗選取的胃癌患者均采用腹腔鏡或開腹胃癌根治術[23]進行治療。胃癌組織幽門螺桿菌(helicobacter pylori，HP)采用硼酸亞甲藍染色法[24]檢測。術后3年內平均每3個月隨訪1次，記錄患者生存等情況。

2 結 果

2.1胃癌患者手術前后miR-203a及其靶基因的表達量比較 在實施手術前，試驗組血液中miR-203a的表達量顯著高于對照組，而試驗組血液中E2F3、ATM和SNAI2的表達量則顯著低于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.01)。試驗組手術后與試驗組手術前相比，miR-203a的表達量顯著下調(P<0.01)，而E2F3、ATM和SNAI2的表達量則顯著上調(P<0.05)，見圖1。

**：P<0.01，與對照組及試驗組手術后比較;*：P<0.05，與試驗組手術前比較

圖1兩組人群血液中miR-203a、E2F3、ATM和SNAI2的表達量

表2 胃癌臨床病理特征與miR-203a、E2F3、ATM和SNAI2相對表達量的關系

圖2 miR-203a及其靶基因的表達與患者生存率的關系

2.2胃癌患者血漿中miR-203a及其靶基因的表達與臨床病理特征的關系 血漿中miR-203a、E2F3、ATM和SNAI2的相對表達量與胃癌患者性別、年齡和幽門螺桿菌感染均無關(表2)，而與分化程度和TNM分期均顯著相關(P<0.05)。此外，miR-203a的表達量與腫瘤大小和淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)，E2F3的表達量與腫瘤大小顯著相關(P<0.05)，ATM的表達量與Laurén分型和淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)。

2.3miR-203a及其靶基因的表達與生存率的預后分析 分別按miR-203a、E2F3、ATM和SNAI2的相對表達量將試驗組分為高值組和低值組。相對表達值大于等于平均相對表達值的患者歸為高值組，相對表達值小于平均相對表達值的患者歸為低值組。各分組患者術后3年內生存率的比較見圖2。miR-203a低值組患者的生存率顯著高于高值組(P<0.05)；而ATM和SNAI2高值組患者的生存率顯著高于低值組(P<0.05);E2F3高值組患者的生存率高于低值組，但差異無統計學意義。

3 討 論

從不典型增生到癌變、腫瘤轉移等過程中，微波RNA及其靶基因在胃癌的每一個發病階段均表現出差異的表達模式。研究它們的相互調控關系，可以了解胃癌的發生機制，為癌癥治療提供新的靶點，為臨床診斷提供準確的標志物[1-2]。目前，miR-203a作為腫瘤抑制因子在胃癌方面的研究報道較多，并且其很可能作用于靶基因E2F3、ATM和SNAI2等調控胃癌發病過程[18-20]。

本研究利用RT-qPCR技術對miR-203a、E2F3、ATM和SNAI2在胃癌患者血漿中的表達進行了檢測。結果顯示，試驗組手術前血漿中miR-203a的表達顯著高于對照組(P<0.01)，而E2F3、ATM和SNAI2的表達顯著低于對照組(P<0.01)。這與它們分別在胃癌和結直腸癌等癌癥中的表達情況基本類似[4,7,17]。試驗組手術后，檢測其血漿中miR-203a、E2F3、ATM和SNAI2的表達量。結果顯示，術后miR-203a的表達量比術前顯著下調(P<0.01)，而術后E2F3、ATM和SNAI2的表達量比術前顯著上調(P<0.05)。這說明miR-203a與靶基因E2F3、ATM和SNAI2的表達呈負調控關系，與之前報道的miR-203a通過調節靶基因抑制腫瘤發生和轉移等結果基本一致[18-20]。這些結果說明miR-203a、E2F3、ATM和SNAI2可能參與了胃癌的發生和發展等過程。

本研究進一步分析了miR-203a及其靶基因的表達量與胃癌臨床病理特征的關系。結果顯示，miR-203a、E2F3、ATM和SNAI2的相對表達量與患者性別、年齡和幽門螺桿菌感染均無關(P>0.05)，但都與分化程度和TNM分期有顯著相關性(P<0.05)。miR-203a和E2F3的表達量與胃癌腫瘤大小顯著相關(P<0.05)，miR-203a和ATM的表達量與淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)，ATM還可能與胃癌Laurén分型相關(P<0.05)。按相對表達量分組分析的結果顯示，miR-203a低表達組的術后生存率高，而E2F3、ATM和SNAI2高表達組的術后生存率高。以上分析表明，miR-203a及其靶基因在胃癌患者手術前后表達差異顯著，且與胃癌的分化程度、TNM分期、術后生存率等臨床病理特征有顯著和穩定的相關性。因此，對血漿中miR-203a及其靶基因的研究可能有助于胃癌的早期診斷、輔助治療和患者預后。