水蛭對IgA腎病血瘀證大鼠治療作用的實驗觀察*

藍 芳 史 偉△ 謝永祥 趙 潔

IgA腎病臨床上以反復(fù)發(fā)作的肉眼或鏡下血尿為主要表現(xiàn)，腎臟病理檢查以光鏡下腎小球系膜細胞增生、基質(zhì)增多，免疫熒光下可見系膜區(qū)廣泛 IgA沉積為特點，其病情多反復(fù)，病程冗長。中醫(yī)認為其肉眼或鏡下血尿為體內(nèi)血不歸經(jīng)的一種表現(xiàn)，“出血必有瘀滯”，而其病程長，則有“久病入絡(luò)為血瘀”之說，故認為血瘀證幾乎貫穿 IgA 腎病始終。水蛭作為傳統(tǒng)的中藥材，因其破血通經(jīng)、逐瘀消癥之功，廣為臨床研究應(yīng)用，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)水蛭中包含各種抗凝血成分，其中天然水蛭素是目前發(fā)現(xiàn)最強的抗凝藥物，抑制凝血酶活性，具有抗血栓形成，改善瘀血狀態(tài)的功用[1],同時研究發(fā)現(xiàn)水蛭有抑制腎間質(zhì)纖維化的進展[2]。本研究通過觀察水蛭對IgA腎病血瘀證大鼠腎功能、尿蛋白定量、血液黏度的影響，探討水蛭對血瘀證IgA腎病的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗用清潔級6周齡的Wistar 雄性大鼠80只，體質(zhì)量180～200 g，動物合格證號：SCXK桂2014-0002，購自廣西食品藥品監(jiān)督管理局。

1.2 實驗藥物水蛭免煎顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，每10 g相當(dāng)于生藥10 g；醋酸潑尼松片(浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn))，5 mg/片。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、尿蛋白定量(24hUpro)測試盒均購自南京建成生物工程研究所，白介素-6(IL-6)采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測，試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司,批次：W09013962，按試劑盒說明書操作。

1.3.2 儀器 Beckman CX-7全自動生化分析儀，TGL-16 H 高速低溫離心機(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，LB-2A全自動血流變測試儀(天津市唐宇醫(yī)療器械科技發(fā)展有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與模型建立購進實驗大鼠后，在廣西中醫(yī)藥大學(xué)清潔級實驗室進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周；大鼠按數(shù)字表隨機分為血瘀證組(60只)、空白對照組(20只)。血瘀證組運用脂多糖牛血清白蛋白+脂多糖+四氯化碳方法建立實驗性 IgAN模型[3，4]，造模成功后隨機分為：模型組、強的松治療組、水蛭組，共3組，每組20只。

1.4.2 給藥方法所有各組14周內(nèi)進食進水不限。其中空白對照組及模型組予正常飲食和生活，不予任何干預(yù)，直至第14周末；強的松治療組，造模成功后每日早上予強的松懸液2 ml，灌胃給藥至14周末，強的松5.5 mg/kg/d；水蛭組：造模成功后每日早上予強的松懸液2 ml，予水蛭懸液2 ml，灌胃給藥至14周末，水蛭用量為1.2 g/kg/d，強的松5.5 mg/kg/d。

1.4.3 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)1)實驗各組造模成功后，分別用代謝籠收集0 d、14周的24 h尿，取標(biāo)本送至廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科檢測24 h尿蛋白定量(Up)。2)實驗各組造模成功后，隨機取每組10只大鼠腹主動脈血3 ml于非抗凝真空采血管中，離心，取上清分裝，-80 ℃冰箱保存；實驗終點14周末同上方法取各組余下大鼠腹主動脈血3 ml于非抗凝真空采血管中，離心，取上清分裝，-80 ℃冰箱保存；以上標(biāo)本按照試劑盒說明書分別行尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白介素-6(IL-6)檢測；同時留取腹主動脈血1 ml，注入含有 3.2% 枸櫞酸鈉抗凝( 抗凝劑與血液比例為 1∶9) 的試管中，用LB-2A全自動血流變測試儀行全血粘度及血漿黏度檢測。

2 結(jié)果

2.1 水蛭對腎功能、肌酐、尿蛋白定量、IL-6的影響造模成功后，模型組BUN、Scr、Up、IL-6均較空白對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)治療后，強的松治療組及水蛭組BUN、Up、IL-6均較模型組顯著下降(P<0.01)，強的松治療組Scr較模型組顯著下降(P<0.05)，但水蛭組療效較強的松治療組更顯著(P<0.01)。見表1。

表1 水蛭對腎功能、肌酐、尿蛋白定量、IL-6的影響 (只，

注：與空白對照組相比，1)P<0.01；與模型組相比，2)P<0.01，3)P<0.05；與強的松治療組相比，4)P<0.01

2.2 水蛭對血液黏度的影響與空白對照組相比，模型組高切、中切、低切及血漿黏度顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，強的松治療組及水蛭組均可顯著降低全血黏度及血漿黏度(P<0.01)；水蛭治療組療效顯著優(yōu)于強的松治療組(P<0.01)，水蛭治療組高切全血黏度及血漿黏度與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討論

對于IgA 腎病的中醫(yī)認識，中醫(yī)學(xué)并沒有明確記載，但從本病的常見臨床表現(xiàn)，IgA 腎病可歸屬于中醫(yī)學(xué)中“尿血”“腎風(fēng)”“水腫”“虛勞”“腰痛”等范疇。而對其中醫(yī)病機分析，侯丕華等[5]認為本病主要為虛證為主，腎虛為綱，虛實夾雜，證候遷延，瘀血推動疾病進展；曹式麗[6]認為 IgA 腎病病機為瘀毒病理產(chǎn)物堆積形成瘀血;或熱毒血絡(luò)血溢脈外，或久病氣虛，統(tǒng)攝失司，而導(dǎo)致血凝脈外形成瘀血，瘀血促進疾病的發(fā)生發(fā)展，在潘莉等[7]的研究中， 316 例 IgA 腎病患者的中醫(yī)證候，血瘀證為最常見的兼證，故認為 IgA 腎病主要病機為本虛標(biāo)實，血瘀是 IgA 腎病的重要邪實之一，也是本病發(fā)展轉(zhuǎn)歸的致病因素，提示 IgA 腎病治療中，活血化瘀是極其關(guān)鍵的治則。

表2 水蛭對血液黏度的影響 (只，

注：與空白對照組相比，1)P<0.05，3)P>0.05；與模型組相比，2)P<0.01；與強的松治療組相比，4)P<0.01

本研究選用水蛭治療IgA 腎病，水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，功“主逐惡血，瘀血，月閉，破血產(chǎn)瘕積聚，無力，利水道”，水蛭其味辛咸、性平。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其主要成分為蛋白質(zhì)及多肽類大分子，如水蛭素、肝素、組織胺、吻蛭素等。而其主要成分水蛭素(hirudin)是天然凝血酶特異性抑制因子，是高效凝血酶抑制劑，能降低纖維蛋白原、血小板聚集率和尿N-乙酞-β-D 氨基葡萄糖酶，具有明顯的抗凝抗栓、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集及降脂作用，同時有抗炎、抗細胞凋亡功效。研究表明，水蛭還可以降低腎組織內(nèi)MMP-2、TIMP-2 水平調(diào)節(jié)腎臟細胞外基質(zhì)的代謝，抑制腎臟纖維化的發(fā)生，也提示水蛭可以改善IgA 腎病患者瘀血狀態(tài)[8]。水蛭素可以通過干預(yù)蛋白分子的表達，改善IgA 腎病血瘀證預(yù)后[9]。

在本研究結(jié)果中，予強的松基礎(chǔ)治療同時加用中藥水蛭，可改善大鼠腎臟功能，尿素氮、肌酐較模型組及強的松治療組顯著下降，同時可減少尿蛋白定量，改善全血黏度及血漿黏度，下調(diào)IL-6。血液流變性、凝血、纖溶、微循環(huán)等理化檢測異常，提示血循環(huán)瘀滯，為血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[10]，故認為改善其血液黏度可改善血瘀證癥狀，郭玉東等[11]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參片能降低急性血瘀模型大鼠的全血黏度、血漿黏度、纖維蛋白原含量等，提出復(fù)方丹參片可能通過降低血液黏度和抑制血小板聚集從而起活血化瘀的作用。莫超等[12]認為水蛭及其提取物可以改善腎病血瘀證患者預(yù)后，保護腎功能。

IgAN 與炎癥因子關(guān)系密切，可加速 IgAN 的進展，故清除腎臟炎性因子對IgAN 具有重要意義，IL-6是與機體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答反應(yīng)密切相關(guān)的細胞因子，其可促使系膜增生，導(dǎo)致腎臟血流動力學(xué)的改變，促使腎小球系膜細胞纖維化，導(dǎo)致腎小球腎炎病情進展，是加速病情進展至終末期腎病的獨立風(fēng)險。本研究應(yīng)用水蛭治療血瘀證IgA腎病大鼠，可顯著下調(diào)IL-6水平，提示水蛭同時有抗炎作用，這可能是水蛭抗腎纖維化的作用機制之一。

綜上所述，水蛭可改善IgA腎病血瘀證大鼠全血黏度及血漿黏度，下調(diào)IL-6，減少尿蛋白，保護腎功能。下一步可繼續(xù)深入研究以找到水蛭對 IgA 腎病血瘀證干預(yù)機制及作用靶點，為臨床使用水蛭治療 IgA 腎病血瘀證提供更豐富的理論依據(jù)。