糞腸球菌R-WL發酵培養基的優化

胡紅偉，麻嘯濤，閆凌鵬，陳茹茹，張嬋娟，楊京娥，李自茹，黨亞鵬，任 帥

（山西大禹生物工程股份有限公司，山西運城 044600）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是乳酸菌中的一類，屬于鏈球菌科腸球菌屬，是革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性球菌，鏈狀排列，無芽孢，兼性厭氧（Ben 等，2018；Amachawadi等，2018）。 糞腸球菌是人和動物腸道的一類重要菌群，可參與機體多種代謝活動（Hwanhlem 等，2017；Ba 等，2017）。 糞腸球菌可產生多種腸球菌菌素，對機體健康具有重要意義，另外，在菌種生長代謝過程中產生多種代謝產物，如乳酸、乙酸、過氧化氫和甘露聚糖肽等，乳酸和乙酸可使腸道pH下降，拮抗病原菌的生長繁殖，過氧化氫和甘露聚糖肽等可殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌 （Allameh等，2017；Li等，2017；Chen 等，2017；Song 等，2016）。 糞腸球菌作為益生菌已經在醫學和飼料領域得到廣泛的應用（Liu 等，2017；Zeng 等，2016；Perumal等，2016）。

制備糞腸球菌高濃菌粉，需要使糞腸球菌菌體密度最大，但是糞腸球菌存在抗逆性差和培養后期自溶的缺點（Silva等，2013），因此，根據菌種生理特性，優化效果最佳的培養條件和增菌培養基，能夠改進發酵進程，有效利用培養基中營養成分，獲得高密度培養的糞腸球菌菌體，從而降低生產成本（Liu 等，2014；Zhang等，2009）。

本實驗室前期從環境中分離得到一株乳酸菌R-WL，經鑒定為糞腸球菌，為實現該糞腸球菌的工業化生產，提高單位體積菌體密度，本研究在MRS培養基基礎上，對糞腸球菌的培養條件和培養基成分進行優化，利用單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、Box-Behnken試驗和響應面分析法 （Hassani等，2015；Yoo等，2008）優化糞腸球菌 R-WL的培養基成分，旨在提高發酵培養基中單位體積的有效活菌數，實現糞腸球菌的高密度培養，為糞腸球菌活菌制劑的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 糞腸球菌R-WL，本實驗室分離，具有較好的益生特性。

1.1.2 培養基 MRS液體培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、檸檬酸二銨2 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉 5 g、磷酸氫二鉀 2 g、硫酸鎂 0.58 g、硫酸錳0.25 g、碳酸鈣 3 g、pH 6.8，水 1000 mL。115 ℃高壓滅菌20 min；此培養基用于菌種活化復壯。

計數培養基：在MRS液體培養基成分中再加入2%瓊脂粉，煮沸后混合均勻，調節pH為6.2，115℃高壓滅菌20min，此培養基用于活菌計數。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 取凍存甘油管糞腸球菌R-WL，于MRS試管活化24 h，平板計數，挑單菌接入盛有100 mL液體MRS培養基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫搖床37℃、120 r/min培養18 h，備用。

1.2.2 發酵培養 將活化后的試管菌種按照2%的接種量接入各發酵培養基中，于37℃、160 r/min條件下，培養14 h，檢測活菌數。

1.2.3 活菌數含量測定 根據GB/T4789.35-2010《食品衛生微生物學檢驗食品中乳酸菌》，采用MRS平板菌落計數法，測定菌液中糞腸球菌活菌含量。

1.3 試驗設計

好歹他們勤勞的本色不變：楊秋香該忙家務活兒還忙家務活兒，有時她也到超市幫忙干點雜活兒。楊力生該接待往來客戶，還是熱心地接待往來客戶，夫妻二人各盡其責，但就是誰也不肯先理睬誰。

1.3.1 生長曲線建立 取活化好的種子液，1%接種于盛有100 mL液體MRS培養基后，于37℃、160 r/min搖瓶培養，以空白MRS培養基為對照，將菌液用無菌MRS稀釋3倍測定初始濃度所對應的吸光值OD600nm，每隔2 h測定一次，至48 h培養結束，以時間（h）為橫坐標，OD600nm為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.2 R-WL培養條件優化

1.3.2.1 糞腸球菌R-WL最適生長pH的測定取活化好的種子液，1%接種到40%裝液量 （250 mL三角瓶裝 100 mL）的不同 pH（pH=5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0） 的 MRS 培養基， 于 37 ℃、160 r/min培養14 h后測定活菌數。

1.3.2.2 糞腸球菌R-WL最適生長溫度測定 將MRS培養基調整pH 8.5，然后將糞腸球菌以1%的接種量接種到裝液40%的MRS培養基中，分別置于不同溫度（T=33、35、37、39、41 ℃）的恒溫搖床中，160 r/min培養14 h，測定活菌數。

1.3.2.3 糞腸球菌R-WL最適接種量的測定 選擇不同接種量1%、2%、3%、5%、9%，接種到裝液量40%的MRS培養基中，調整pH 8.5，培養溫度37℃，160 r/min培養14 h，測定培養液活菌數。

1.3.3 發酵培養基優化

1.3.3.2 氮源的篩選 硫酸銨、蛋白胨、豆粕、豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨+酵母膏（1∶1），以 10、20、30 g/L濃度替代MRS培養基中復合氮源（蛋白胨、牛肉膏、酵母膏），另設MRS培養基為對照組，250 mL三角瓶裝液量100 mL，37℃、160 r/min培養14 h后用MRS培養基計數，做兩個平行。

1.4 Plackett－Burman設計法篩選顯著影響因素Plackett－Burman試驗設計法通過分析每個影響因素的兩個水平，比較兩水平的差異和整體的差異，從而確定每個因素的顯著性，達到快速準確篩選出主效因素的目的；根據培養基篩選出的最適碳源、氮源、無機鹽后，進行Plackett-Burman試驗。選取最佳碳源、最佳氮源、檸檬酸二銨、結晶乙酸鈉、檸檬酸氫二鉀、無水硫酸鎂和硫酸錳進行Plackett-Burman試驗，以篩選影響糞腸球菌發酵活菌數的3個顯著影響因子。

1.5 Box-Behnken試驗設計 根據Box-Behnken試驗設計模塊，每個顯著性因素取3個水平，以糞腸球菌R-WL活菌數對數值為響應值，設計3因素3水平共15個試驗點的響應面試驗，分析各因素的主效應和交互效應，繪制等高線和響應曲面，在一定范圍內求出最佳值，得出最佳培養基配方。

1.6 數據統計與分析 試驗結果均以 “平均數±標準差”的形式表示，利用SAS 9.3軟件對試驗數據進行單因子方差分析（one-way ANOVA，LSD），P<0.05和P<0.01為數據在統計學上差異顯著。試驗作圖采用Origin 9.0完成。

2 結果與分析

2.1 糞腸球菌的生長曲線 根據所測菌液OD600值繪制糞腸球菌R-WL的生長曲線 （圖1），可以看到0~2 h菌體濃度上升較緩和，這是菌種進入新環境的適應階段，為該菌種的延滯期；2~14 h糞腸球菌菌體濃度快速生長至最高峰，該時期曲線基本接近直線，說明該時期是糞腸球菌生長最快的時期，為其對數生長期；14 h之后，菌液濃度變化比較穩定，說明此時糞腸球菌進入生長穩定期，選取14 h為該菌種最適培養時間。

圖1 糞腸球菌R-WL生長曲線

2.2 培養條件優化

2.2.1 糞腸球菌R-WL最適生長pH的測定 菌種R-WL在不同pH培養基中的活菌數見圖2，初始pH為7.5、8、8.5和9.0時，活菌數較高，各組間差異不顯著（P>0.05），與其他pH組差異極顯著（P<0.01），活菌數最高的pH為8.5，最終菌體濃度為3.8×109cfu/mL，說明隨著培養基初始pH的升高，菌種后期所產乳酸的中和能力增強，減輕了乳酸對菌體的毒害作用，因此，確定該糞腸球菌最適pH為8.5。

圖2 不同初始pH對糞腸球菌R-WL活菌數的影響

2.2.2 糞腸球菌R-WL最適生長溫度的測定 由圖3可知，不同溫度之間最終活菌數差異不顯著（P>0.05），說明菌株R-WL在37~41℃具有較強的適應性，隨著溫度升高，活菌數先升高后下降，溫度在37℃時，菌種R-WL活菌數最高，達到3.96×109cfu/mL，說明溫度對菌種的生長具有一定影響，該菌種在溫度為37℃時，菌種的代謝最為旺盛，對營養物質利用率提高，進而提高最終活菌數。因此，確定糞腸球菌R-WL最適溫度為37℃。

圖3 不同培養溫度對糞腸球菌R-WL活菌數的影響

2.2.3 糞腸球菌R-WL最適接種量的測定 由圖4可知，不同接種量之間活菌數在P=0.01水平上差異不顯著，隨著接種量的增加，糞腸球菌RWL活菌數先升高后下降，在3%接種量時，活菌數達到最大值，為3.36×109cfu/mL，與1%接種量活菌數差異不顯著（P>0.05），但活菌數顯著高于其他各組（P<0.05），原因可能是，隨著接種量的增加，縮短了菌種R-WL的延滯期，促進了菌種迅速進入對數期，但隨著接種量超過5%以后，由于初始接種量過大，帶入較多菌種次級代謝產物，反而抑制了菌種的生長，因此，綜合考慮，選取3%為最適接種量。

2.3 發酵培養基優化

2.3.1 碳源篩選試驗 由圖5可知，乳糖做碳源時，與玉米粉、麩皮、糖蜜、蔗糖及可溶性淀粉各組活菌數差異極顯著（P<0.01），與對照組（葡萄糖）差異不顯著（P>0.05），乳糖各濃度之間活菌數差異不顯著（P>0.05），以麩皮和可溶性淀粉做碳源時，活菌數顯著小于其他各組（P<0.05）；說明菌種R-WL能較好利用葡萄糖或乳糖，對麩皮和可溶性淀粉中的多糖較難利用，根據活菌數情況，選擇最適碳源為乳糖，最適濃度為10 g/L。

圖4 不同接種量對糞腸球菌R-WL活菌數的影響

圖5 不同碳源及其濃度對糞腸球菌R-WL活菌數的影響

2.3.2 氮源篩選試驗 由圖6可知，對照組、蛋白胨組及蛋白胨+酵母膏組活菌數大于豆餅粉組、豆粕組、花生餅粉組及硫酸銨組，蛋白胨+酵母膏組、蛋白胨組最高活菌數為3.40×109cfu/mL及3.21×109cfu/mL，豆餅粉、豆粕、花生餅粉及硫酸銨組活菌數最高分別為 0.43×109、0.38×109、0.64×109、0.07×109cfu/mL， 極顯著低于蛋白胨+酵母膏組、蛋白胨組和對照組（P<0.01）；說明菌株R-WL對動物性氮源利用較充分，對植物性氮源及無機氮源的利用效果較差，動物性有機氮源中含有糞腸球菌R-WL生長所需氨基酸等物質，植物性氮源的氨基酸組成與菌株R-WL的生長需求不一致，無機氮源需要經微生物代謝轉化才能合成菌株所需氨基酸；蛋白胨+酵母膏組活菌數高于其他各組，與對照組差異不顯著（P>0.05），選取蛋白胨+酵母膏為最適氮源，最適濃度為30 g/L。

圖6 不同氮源及其濃度對糞腸球菌R-WL活菌數的影響

2.4 Plackett-Burman試驗結果 根據以上單因素試驗結果，將篩選到的最佳碳源乳糖、最佳氮源酵母膏+蛋白胨代替MRS培養基中的葡萄糖、復合氮源作為優化培養基的成分，并將乳糖、酵母膏、蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、碳酸鈣共9個因子作為Plackett-Burman試驗設計的基本因素，另設2個虛擬變量估計試驗誤差，各因子取高低2個水平，響應值為單位體積糞腸球菌活菌數的對數值（Y），試驗設計見表1，其中F與L為虛擬項，試驗結果見表2。對試驗結果進行統計分析，可得各因子的效應及其顯著性（表3），由表3可知，在糞腸球菌R-WL培養過程中，在α=0.1水平上，蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨對糞腸球菌R-WL活菌數的對數值影響顯著，其中檸檬酸二銨為正效應，蛋白胨和乙酸鈉為負效應，因此將這3個因子做Box-Behnken試驗。

表1 Plackett-Burman試驗設計

表2 Plackett-Burman試驗結果

表3 Plackett-Burman試驗設計各因子效應及顯著性

2.5 最陡爬坡試驗及結果 根據Plackett-Burman試驗篩選結果，選取蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸銨為三個顯著性因子進行最陡爬坡試驗以獲取活菌數最高的區域，根據各因子的系數及實際情況，設置4個梯度，結果如表4所示，梯度0+2Δ所對應的活菌數最高，故采用蛋白胨11 g/L、乙酸鈉4 g/L、檸檬酸二銨4 g/L為后續響應面試驗的中心點。

表4 最陡爬坡試驗結果

2.6 響應面設計確定顯著影響因素的最佳值采用Box-Behnken試驗設計，對蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨的濃度配比進行優化，以活菌數的對數值為響應值，各因子設置3個水平（見表5），優化結果如表6所示。

表5 Box-Behnken試驗因素水平及其編碼

表6 Box-Behnken試驗設計及結果

根據Box-Benhnken試驗結果，采用Design Expert 8.06軟件響應面分析程序對其進行回歸擬合，得到二次多元回歸模型為：Y=9.77+0.040A+0.037B+0.01C+0.01AC+0.01BC-0.042A2-0.017B2-0.013C2（Y為活菌數對數預測值，A、B、C分別代表蛋白胨、乙酸鈉和檸檬酸二銨），對所得回歸方程進行方差分析 （表7），可知：模型P值為0.0042，回歸項極顯著（P<0.01），表明本模型是有效的；失擬項P值為0.2301，失擬項不顯著（P>0.05），表明本模型不存在失擬現象；試驗的精確度以變異系數（CV）表示，CV值越低，試驗可靠性越強，本試驗CV值為0.16%（表8），說明試驗結果可信，R2Adj為89.88%，表明響應面89.88%的變化可以用此回歸模型進行解釋，該模型與實際變化擬合較好，可用于糞腸球菌R-WL培養基優化的預測。

表7 回歸擬合方程方差分析

表8 模型可信度分析

利用Design Expert 8.06軟件對回歸模型進行響應面分析，繪制活菌數對數值的等高線和曲面圖（圖7~圖9），等高線圖的圓心越接近橢圓表示交互作用越強，等高線的稀疏表示響應面圖形的平陡。從3組圖中可以直觀看出活菌數對數值存在最大響應值，利用Design Expert 8.06軟件的Optimization模塊，對響應值求極值，得出蛋白胨、乙酸鈉、檸檬酸二銨添加量分別為12.18、4.5、4.5 g/L時，糞腸球菌R-WL的活菌數對數值存在最大值9.81221，所對應的活菌數為6.46×109cfu/mL。

圖7 蛋白胨和乙酸鈉交互影響對糞腸球菌RWL活菌數的等高線和曲面圖

圖8蛋白胨和檸檬酸二銨交互影響對糞腸球菌R-WL活菌數的等高線和曲面圖

圖9乙酸鈉和檸檬酸二銨交互影響對糞腸球菌R-WL活菌數的等高線和曲面圖

2.7 最優配方驗證 為了檢驗模型的可靠性，將優化后的培養基與原培養基（MRS培養基），在相同條件下進行5次搖瓶發酵試驗。試驗結果見圖10，優化后培養基與MRS培養基所得活菌數分別為（6.44±0.10）×109cfu/mL 和（3.76±0.17）×109cfu/mL，優化后結果與預測值接近，可見模型能較好預測發酵液活菌數。

圖10 優化前后培養基活菌數變化

3 討論

3.1 培養條件優化 乳酸菌培養過程中，利用培養基中的糖類發酵為乳酸，糞腸球菌培養后期，乳酸大量積累，對菌體的生長產生抑制作用，為減輕培養過程中高酸環境對菌體的毒害，經常在培養過程中加入堿性物質中和。許多研究表明，添加中和劑是提高乳酸菌活菌數的一個有效手段（閔偉紅等，2009；張廣敏等，2009）。 本研究通過調節初始pH來研究糞腸球菌R-WL活菌數的變化，發現隨著pH升高活菌數升高，到一定程度開始下降，原因可能是較高的pH能中和發酵過程中更多的有機酸，有利于菌種的生長。

溫度是微生物生長過程中的一個重要影響因素，改變溫度會影響微生物體內所進行的多種化學反應（Lopes等，2018）。本試驗在33~41℃，對培養糞腸球菌R-WL活菌數的變化進行了研究，雖然各組活菌數差異不顯著（P>0.05），隨著溫度升高，活菌數有先上升后下降趨勢，與劉香英等（2018）的研究結果一致。溫度過高或過低可能會出現菌種R-WL生物合成量過低及生長延長等不良現象，微生物代謝的蛋白酶、淀粉酶等酶制劑活力受溫度影響，適宜的溫度能促進酶活力的發揮，有效利用營養物質，從而促進菌體密度的提高。

3.2 發酵培養基優化 碳源是微生物生長所需的重要營養要素，也是微生物細胞結構或代謝產物中碳來源的營養物質（岑沛霖等，2011），不同微生物利用碳源的能力不同。本試驗研究了乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糖蜜、玉米粉和麩皮作為碳源時對菌種R-WL生長的影響，發現乳糖、葡萄糖對菌種的促生長效果較好，麩皮、可溶性淀粉、玉米粉的效果較差，原因可能是菌種RWL對單糖和雙糖利用較快，而麩皮、淀粉和玉米粉等多糖需要微生物產淀粉酶分解為二糖或單糖進行利用，菌種R-WL產酶能力較差導致對多糖的利用不充分，菌種生長受到抑制。

氮是組成核酸和蛋白質的重要元素，其對微生物的生長發育有著重要作用。不同微生物能利用的氮源差異較大。本試驗分別研究了6種氮源對菌種R-WL的促生長效果，結果表明，蛋白胨+酵母膏組的活菌數最高，這與Djellouli等（2017）與 Kwon等（2000）研究結果相似。 蛋白胨、酵母膏中的氮以氨基酸形式存在，氨基酸可以被微生物直接吸收參與細胞代謝，而豆粕、豆餅粉、花生餅粉以蛋白質形式存在，需要分解為氨基酸才能利用，糞腸球菌為異氧型微生物，對硫酸銨中的無機氮無法利用，可能是菌株R-WL在豆粕、豆餅粉、花生餅粉及硫酸銨中活菌數較低的原因。

3.3 響應面試驗 響應面法（RSM），也稱響應曲面法，是通過對應曲面及等高線的分析尋求最優工藝參數，用多元二次回歸方程來擬合響應值與因素之間函數關系的一種優化統計方法（Montgomery 等，2009；Box，1990）。 試驗證明，Plackett-Burman設計與響應面方法（RSM）相結合的試驗統計方法能快速、有效地影響糞腸球菌R-WL液體培養的因素，并將顯著性因素進行建模分析，得到最佳工藝參數。

4 結論

本試驗結果表明，糞腸球菌R-WL最適培養條件為：時間14 h、pH 8.5、溫度37℃、接種量3%、最佳碳源為乳糖、最佳氮源為蛋白胨+酵母膏。優化后的培養基配方為：乳糖10 g/L、酵母膏15 g/L、蛋白胨 12.18 g/L、乙酸鈉 4.5 g/L、檸檬酸二銨4.5 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、輕質碳酸鈣3 g/L，初始pH 8.5。將此優化后培養基與原MRS培養基在最適培養條件下進行培養，所得活菌數分別為（6.44±0.10）×109cfu/mL 和（3.76±0.17）×109cfu/mL，比優化前活菌數提高了71.28%。