乳酸菌對低溫下玉米秸稈黃貯發酵品質及有氧穩定性的影響

謝華德，李苗苗， 靳思玉， 王立超， 曹 陽

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319）

玉米秸稈是子實收獲后留下的含纖維成分高、質地比較粗硬的農作物副產物。對玉米秸稈進行青貯、黃貯、微貯等發酵處理可以軟化秸稈，提高其營養價值、改善適口性、并提高飼料轉化率，是一種有效開發利用秸稈資源的方式（劉海燕等，2016；孫文等，2010；刁其玉等，2005）。發酵飼料的質量通常會受到原料種類、原料品質、貯藏溫度、附生乳酸菌等因素的影響（Liu等，2011；Kim等，2006；Lin 等，1992；McDonald 等，1966）。其中，乳酸菌在制作發酵飼料時起著關鍵的作用（Hu等，2009；趙政等，2009）。在厭氧發酵的環境中，乳酸菌大量繁殖，從而將飼料中的淀粉和可溶性糖變成乳酸，降低pH，抑制丁酸菌、大腸桿菌及霉菌等有害細菌的生長，從而提高發酵飼料質量（Cao等，2011；趙輝等，2010；Cai等，1999）。 然而，當玉米收割期到來時，我國北方的氣溫下降，尤其東北地區急劇下降，平均氣溫達到4°C左右（郭志梅等，2005）；在低溫條件下發酵的飼料，乳酸菌的活性受到抑制，乳酸發酵很難充分進行，難以達到調制高質量發酵飼料的目的 （Liu等，2012；Cao等2011）。另外，當開貯取料時，厭氧環境被破壞，發酵飼料接觸空氣后，細菌、酵母菌及霉菌等有害微生物活動旺盛，出現好氣性腐敗，并產出大量的熱，飼料中的乳酸含量迅速下降，pH上升，氨態氮濃度增加，從而破壞發酵飼料在厭氧條件下的 穩 定 性 （Liu 等 ，2013；McDonald 等 ，1991；Woolford，1990）。

本試驗采用小規模發酵法，在低溫條件發酵的黃貯玉米秸稈中添加不同的乳酸菌，探究其對玉米秸稈黃貯的發酵品質、微生物數量以及有氧穩定性的影響，以期篩選出低溫下高效發酵乳酸菌，為低溫季節或低溫地區調制高品質秸稈發酵飼料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 玉米秸稈取自黑龍江八一農墾大學試驗田，然后將其鍘短至1~2 cm，水分調整為65%；乳酸菌由日本國立畜產基地研究所提供，分別是 LAB1（Chikuso-1）、LAB2（Master-LP）和LAB3（Master-AC）。

1.2 乳酸菌添加處理 試驗處理包括一個對照組及乳酸菌 LAB1組、LAB2組、LAB3組、LAB1+LAB2組、LAB1+LAB3組和LAB2+LAB3組。采用小規模發酵法，稱取300 g備用的秸稈原料，裝入16 cm×25 cm的食品級聚乙烯袋內，每個處理組4袋（共28袋），真空密封后，置于4°C條件下發酵。在30 d后，每種處理各開封3袋，檢測相關指標。1.3 測定項目及方法

1.3.1 發酵特性 開封后立即稱取黃貯發酵的飼料樣品20 g，加入180 mL滅菌水，用均質器拍打90 s使其充分混勻，再進行過濾。濾液用于測定飼料pH及有機酸。有機酸的測定：濾液經2000 r/min離心5 min，用0.22 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜儀（色譜柱KC-811，檢測器SPD-M10AVP，柱溫 50°C，流速 1 mL/min，檢測波長 210 nm，進樣量 5 μL），檢測乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。

1.3.2 微生物組成及數量 稱取20 g玉米秸稈原料以及黃貯發酵后的飼料樣品于聚乙烯塑料袋內加180 mL滅菌水，用均質器拍打90 s使其充分混勻，在塑料袋內取1 mL混合液，將其在滅菌的試管中依次按梯度稀釋成10-1、10-3、10-5倍液，用乳酸菌培養基（MRS）、營養瓊脂培養基（NA）、大腸桿菌顯色鑒別培養基（BLB）、強化梭菌鑒定瓊脂（DRCA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，分別檢測乳酸菌、一般細菌和耐熱菌、大腸桿菌、丁酸菌、霉菌和酵母菌。混合液涂布到培養基后，將大腸桿菌、酵母菌、霉菌、耐熱性菌（濾液在75°C水浴鍋中加熱15 min后涂板）置于30°C恒溫培養箱中培養48 h，乳酸菌、丁酸菌置于30°C厭氧培養箱中培養48 h后，分別計數（單位質量新鮮樣品中微生物數量 lg cfu/g FM）（Cao等，2011）。

1.3.3 有氧穩定性試驗 在發酵30 d開封后，取各個袋發酵的樣品100 g，放入1000 mL無蓋的聚乙烯瓶中，敞口放置，通過檢測發酵飼料的溫度變化，考察其有氧氧化情況。即在室溫條件下，連續測試容器內飼料的溫度，當飼料溫度比室溫高于2 °C 時，被認為發生有氧氧化（Nishino等，2004），并測定其pH、有機酸、NH3-N和微生物含量。

1.4 數據統計與分析 采用Excel軟件整理基礎數據后，采用SAS 9.2統計軟件進行方差分析，并用Tukey法對數據進行多重比較，結果以 “平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 玉米秸稈原料的化學成分及微生物含量由表1可看出，玉米秸稈原料的干物質含量為91.28%，有機物、粗蛋白質、粗脂肪、酸性洗滌纖維及中性洗滌纖維分別為干物質含量的90.07%、5.18%、1.18%、44.86%及67.22%。同時，在玉米秸稈原料中檢測到乳酸菌及耐熱菌的數量達104，一般細菌、大腸桿菌及酵母菌的數量均達到107，原料中丁酸菌的數量為103。

表1 玉米秸稈原料的化學成分及微生物

2.2 乳酸菌對低溫條件下玉米秸稈黃貯發酵品質的影響 由表2可以看出，試驗LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的 pH 分別較對照組降低了 7.32%、8.44%、11.32%、6.95%、5.71%、8.82%（P<0.05）；其中，LAB3組的 pH 最低，為 4.65。 與對照組相比，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的乳酸含量分別高了 18.42%、23.68%、32.46%、28.07%、16.67%、26.32%（P<0.05）。 試驗 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的乙酸含量顯著高于對照組（P<0.05），其中LAB3組的含量最高。各組間的丙酸含量均無顯著差異（P>0.05）。LAB1、LAB2、LAB3組的丁酸含量均高于對照組，但均無顯著差異 （P>0.05）。 試驗 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的氨態氮濃度分別較對照組降低了 9.32%、14.20%、21.02%、10.34%、11.04%、14.20%（P<0.05）， 其中 LAB3組下降的幅度最大，為21.02%。

2.3 乳酸菌對低溫條件下玉米秸稈黃貯微生物數量變化的影響 由表3可以看出，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的乳酸菌數量均大于對照組，其中LAB3組最多，為7.91 lg cfu/g FM （P<0.05）。 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的一般細菌數量均少于對照組，其中LAB2+LAB3組最少，為6.18 lg cfu/g FM （P<0.05）。 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的大腸桿菌數量均少于對照組，其中，LAB3組最少，為3.14 lg cfu/g FM（P<0.05）。各組間的耐熱菌數量均無顯著差異。各組中均未檢測出丁酸菌和霉菌。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的酵母菌數量顯著小于對照組（P<0.05）。

2.4 乳酸菌對低溫條件下玉米秸稈黃貯有氧氧化后pH、有機酸及氨態氮含量的影響 由表4可知，在發生有氧氧化后，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的 pH 分別較對照組降低了 13.26%、7.62%、14.19%、9.67%、10.54%、10.54%（P<0.05），其中LAB3組的下降率最高，為14.19%。 LAB1、LAB2、LAB3組的乳酸含量均顯著高于對照組和 LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、組（P<0.05）。與對照組相比，LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3組的乙酸含量均顯著增多（P<0.05）。各組間的丙酸和丁酸含量均無顯著差異（P>0.05）。與對照組相比，LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組 的氨態氮含量均顯著降低（P<0.05）。

2.5 乳酸菌對低溫條件下玉米秸稈黃貯有氧氧化后微生物數量變化的影響 由表5可知，在發生有氧氧化后，LAB2+LAB3組的乳酸菌數量顯著高于對照組和 LAB2、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3組（P<0.05）； LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的一般細菌數量均小于對照組，其中 LAB1組顯著減少 （P<0.05）。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的大腸桿菌數量均小于對照組，其中LAB1+LAB2組最少，但無顯著差異 （P>0.05）。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的耐熱菌數量均小于對照組，其中LAB3、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的數量顯著降低 （P<0.05）。LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的丁酸菌數量均小于對照組，其中LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組最少（P<0.05）。 LAB1、LAB2、LAB3、LAB1+LAB2、LAB1+LAB3、LAB2+LAB3組的霉菌數量均小于對照組，其中，LAB1組最少，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。

表2 低溫下玉米秸稈發酵30 d的發酵品質測定結果

表3 低溫下玉米秸稈發酵30 d的微生物數量檢測結果lg cfu/g FM

表4 玉米秸稈發酵30 d有氧氧化后的pH、有機酸及氨態氮含量的變化

3 討論

3.1 玉米秸稈原料的化學成分及微生物 發酵飼料成功的關鍵在于提供適宜的條件。為創造厭氧環境要把原料壓實，而水分含量過低，不易壓實，所以發酵飼料適宜的水分含量為65%~70%（Cao等，2009）。通過對玉米秸稈原料的化學成分檢測發現，干物質含量為91.28%，因此，本試驗通過調整水分含量為65%對玉米秸稈進行發酵。與其他常用的大豆秸稈、谷草和甘蔗梢葉等發酵飼料原料相比，本試驗中使用的玉米秸稈粗蛋白質、粗脂肪和中性洗滌纖維含量較低（吳兆鵬等，2016；閆艷紅等，2014；郭勇慶等，2009）。在玉米秸稈原料中檢測到乳酸菌及耐熱菌的數量達104，一般細菌、大腸桿菌及酵母菌的數量均達到107，丁酸菌的數量為103。主要可能與玉米秸稈原料放置時間過長后導致水分、化學營養成分和附著微生物的含量差異很大有關（Yahaya等，2002；Garcia等，1989）。

3.2 乳酸菌對低溫條件下玉米秸稈黃貯發酵品質的影響 發酵飼料的pH可以反映飼料品質受腐敗菌和霉菌影響的程度。玉米秸稈發酵過程中，pH下降的主要原因是乳酸菌大量繁殖產生乳酸促使發酵飼料酸度降低。王鵬等（2011）對低溫條件下混合乳酸菌制劑對蘆葦發酵品質的影響研究發現，4°C條件下的pH始終穩定在4.20以下，這與本試驗的結果不一致，這可能是不同種類的乳酸菌活性受溫度限制的程度不同。有機酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）含量及其構成比例是鑒別發酵品質的重要指標。賈軍等（2017）研究發現，接種低溫乳酸菌復合菌系可以明顯改善玉米秸稈與馬鈴薯渣混合發酵飼料的品質。劉圈煒等（2013）研究發現，添加復合乳酸菌制劑可改善玉米秸稈青貯品質。王昆昆等（2010）研究發現，添加乳酸菌制劑能降低青貯的pH，提高乳酸含量，改善青貯飼料的青貯品質。Courtin等（1990）報道，乳酸是降低pH的主要有機酸，通常以乳酸在總酸中比例最高為好，這與本試驗結果一致。氨態氮含量也是判定飼料品質的主要指標（劉建新等，1999）。本試驗中，添加乳酸菌可以降低玉米秸稈黃貯飼料的氨態氮含量，表明添加乳酸菌使玉米秸稈附著的乳酸菌數量增多，發酵過程中產生大量的乳酸能減少早期植物蛋白酶對含氮化合物的降解作用，降低氨態氮/總氮含量，改善黃貯發酵飼料的品質（姜義寶等，2017）。

3.3 乳酸菌對低溫條件下玉米秸稈黃貯微生物數量變化的影響 在發酵的好氣性細菌活動階段過后，乳酸球菌大量繁殖，迅速降低pH，促使腐敗菌、丁酸菌等活動受到抑制。本試驗低溫環境雖然會降低乳酸菌發酵速度，但經過30 d的發酵，乳酸菌總數也維持在6.59 lg cfu/g FM及更高水平。Cao等（2011）在研究乳酸菌對菜渣發酵品質及瘤胃體外消化的影響中發現，添加乳酸菌能促進乳酸菌的繁殖，降低pH，抑制好氧性細菌、大腸桿菌、丁酸菌、霉菌及酵母菌的生長，這與本試驗結果一致。未檢測到霉菌，證明玉米秸稈黃貯密封良好，未發生二次發酵，否則發酵飼料會產生霉變腐敗，溫度上升并附著霉菌。

表5 玉米秸稈發酵30 d有氧氧化后微生物數量測定結果lg cfu/g FM

3.4 乳酸菌對低溫條件下玉米秸稈黃貯有氧氧化后pH、有機酸及氨態氮含量的影響 當發酵窖打開后，發酵飼料暴露于空氣中，好氧微生物分解乳酸和殘余的水溶性碳水化合物 （WSC）產生CO2，同時也會分解蛋白質和氨基酸為氨或胺類物質，導致pH升高，飼料消化率降低，適口性降低（Woolford，1990）。 McDonald 等（1991）研究發現，發酵飼料暴露在空氣中有機酸會明顯減少，這與本研究的結果一致。Filya等（2000）在乳酸菌制劑對小麥秸稈青貯的發酵品質及有氧穩定性影響中發現，添加乳酸菌菌劑可以顯著提高小麥秸稈青貯的發酵品質，提高有氧穩定性。張濤等（2007）將布氏桿菌、植物乳桿菌及兩者的復合菌劑加入苜蓿青貯中發現，添加乳酸菌菌劑可以顯著提高苜蓿青貯的發酵品質，延長有氧穩定性的時間。在本試驗中，在低溫條件下發酵的玉米秸稈黃貯飼料中添加乳酸菌均可提高發酵飼料的有氧穩定性。

3.5 乳酸菌對低溫條件下玉米秸稈黃貯有氧氧化后微生物數量變化的影響 許多研究表明，酵母菌的快速大量繁殖是破壞有氧穩定性的主要原因之一 （Liu 等，2013；Wang 等，2008；McDonald 等，1991；Woolford 等，1990）。本試驗中，酵母菌數量維持較高水平，可能是因為產生的乳酸可為乳酸同化型酵母菌等好氧微生物提供生長繁殖所需要的底物（郭旭生等，2006）。本試驗中，有氧氧化后大腸桿菌、丁酸菌和霉菌數量均顯著增多，表明飼料已經發生腐敗霉變，營養價值減少，飼喂價值喪失。

4 結論

在低溫條件下，添加乳酸菌制劑可有效降低玉米秸稈黃貯飼料pH，增加乳酸菌數量，抑制有害微生物的生長，改善玉米秸稈黃貯品質，同時提高玉米秸稈黃貯的有氧穩定性,其中添加乳酸菌LAB3效果最好。