不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦生長、免疫及抗氨氮脅迫能力的影響

王安琪，郭 立，崔 培，孫金輝，喬秀亭，程鎮燕

（天津農學院水產學院，天津西青 300380）

功能性寡糖作為飼料添加劑，能夠有效促進腸道有益菌的增殖，從而阻止或排除病原菌在腸道的定植、黏附；還可以作為免疫源，引起動物自身的免疫應答反應，提高自身免疫力 （楊曙明，1999）。低聚木糖又稱寡木糖，是較為常見的功能性寡糖，與其他功能性寡聚糖相比，低聚木糖具有獨特的酸穩定性和熱穩定性，且很難被動物的消化酶分解，在飼料中少量添加能發揮很好的作用。目前，已有報道顯示，飼料中添加低聚木糖可以提高異育銀鯽（Carassius auratusgibelio）增重率、腸道淀粉酶活性和肝胰臟蛋白酶活性 （熊沈學，2005）；可以提高大菱鲆（Scophthalmusmaximus）增重率、特定生長率并降低飼料系數 （李勇等，2006）；可以提高草魚（Ctenopharyngodon idellus）血清總蛋白水平，降低尿素氮水平和膽固醇含量（褚武英等，2008）；可以顯著提高歐洲鱸魚（Dicentarchus labrax）生長性能及免疫能力（Torrecillas等，2007）；可以顯著提高奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus）幼魚腸道和肝胰臟的蛋白酶和脂肪酶活力（張榮斌等，2011；強俊等，2009）以及對凡納濱對蝦（L.vannamei）的生長及免疫有明顯的促進作用等（符廣才等，2004）。但對凡納濱對蝦抗氨氮脅迫能力的研究鮮見報道。本試驗擬在基礎飼料中添加不同水平低聚木糖，通過養殖試驗分析低聚木糖對凡納濱對蝦生長、免疫及抗氨氮脅迫能力的影響，以期為低聚木糖在凡納濱對蝦飼料中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 試驗用凡納濱對蝦購自天津恒仟水產養殖場，正式試驗前暫養5 d，使凡納濱對蝦適應養殖環境。選擇健康幼蝦480尾，初始體質量（0.33±0.00）g，隨機分為 4 組，每組 3 個重復，每個重復40尾。凡納濱對蝦幼蝦隨機放入到12個體積為150 L的水槽中進行養殖試驗。正式養殖試驗共持續42 d。

1.2 試驗飼料 使用天津通威飼料有限公司生產的對蝦配合飼料，以魚粉、豆粕、花生粕、魚油、預混料等，加工成硬顆粒飼料，制成基礎試驗飼料，在此基礎上添加 0、250、500、1000 mg/kg 低聚木糖 （山東龍力生物有限公司提供，有效成分≥35%）。飼料配方粗蛋白質含量≥42%，粗脂肪含量≥6%，粗灰分含量≤16%。

1.3 試驗管理 養殖試驗于天津恒仟水產養殖車間內進行。試驗期間連續充氧，保持溶氧量≥6 mg/L。養殖期間每天分別在 8：30、12：30和17：30進行飽食投喂（連續投喂30 min），并觀察凡納濱對蝦的健康狀況和攝食情況，記錄攝食量。每天早上換水、清理殘餌和糞便，每次換水量為50%。飼養試驗期間自然光照，鹽度18‰~19‰，水溫24~28℃，pH 7.8~8.2。

1.4 樣品采集 養殖試驗結束時，禁食24 h，對試驗對蝦進行計數、稱重。每個重復隨機挑選20尾對蝦用1 mL無菌注射器從圍心腔取血，合并置于無菌離心管中，血液采集后靜置4 h，10000 r/min離心10 min，取血清分裝，置于-80℃冰箱保存，用于后續免疫指標等的測定。

1.5 氨氮脅迫試驗 養殖試驗結束后，每個水槽留取凡納濱對蝦15尾用于氨氮脅迫試驗。氨氮脅迫試驗每組設置3個重復，每個重復15尾蝦。根據Wang等（2003）試驗結果，設定的氨氮脅迫試驗總氨氮濃度為37 mg/L。脅迫所用試劑為氯化銨，首先配制10 g/L氯化銨母液，然后根據水槽體積加入適量氯化銨母液。水體中氨氮濃度采用納氏試劑法（Hegazi等，2010）測定，每隔 12 h測定養殖水體氨氮濃度并用氯化銨母液進行調節。脅迫24 h后，采集凡納濱對蝦血清于-80℃保存，用于后續免疫相關指標的測定。

1.6 指標測定

1.6.1 生長性能指標的測定

增重率/（WGR，%）=（Wt-W0）/W0×100；

特定生長率/（SGR，%）=（lnWt-lnW0）/t×100；

成活率/%=Nf/Ni×100；

飼料轉化率/%=（Wt-W0）/F×100；

式中：W0為試驗開始時蝦體重，g；Wt為試驗結束時蝦體重，g；F為飼料攝入量，g；t為試驗天數，d；Nf為終末尾數；Ni為初始尾數。

1.6.2 免疫酶活力的測定 試驗中免疫酶活力及MDA含量測定采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒。SOD活力測定采用Elstner等（1976）的黃嘌呤氧化酶法。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法（Buege等，1978）。T-AOC活力在酸性條件下抗氧化物質可以還原Fe3+-TPTZ產生藍色的 Fe2+-TPTZ（Tang 等，2005），在 593 nm處讀取吸光度。CAT分解H2O2的反應可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2和鉬酸銨作用產生一種淡黃色的絡合物，在405 nm處測定其變化量（Aebi，1984）。AKP 和 ACP 分解磷酸苯二鈉，產生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物。LZM能水解細菌細胞壁上肽聚糖使細菌裂解而濃度降低，透光度增強，故可以根據透光度的變化來推測LZM的含量。PPO能夠催化底物酚產生醌，醌在420 nm處有特征性光吸收。

1.7 統計分析 試驗數據用“平均值±標準誤”表示。對脅迫前或脅迫后，不同水平低聚木糖組間數據采用單因素方差分析（one-way ANOVA），當不同組間有顯著差異時，用Duncan法檢驗進行多重比較；同一組脅迫前后采用t檢驗方法進行分析，顯著水平為0.05，所有數據均使用SPSS 19.0軟件進行處理分析。

2 結果

2.1 不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦生長性能的影響 如表1所示，凡納濱對蝦的成活率為95.85%~100%，不受飼料中低聚木糖水平的影響。隨著飼料中低聚木糖水平的升高，凡納濱對蝦的增重率及特定生長率呈現先上升后下降的趨勢，均在250 mg/kg組達到最高。飼料轉化率在1000 mg/kg組達到最高，但各組間均未達到差異顯著水平（P ＞ 0.05）。

表1 不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦生長性能及飼料利用的影響%

2.2 不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦血清抗氧化能力的影響 如圖1所示，氨氮脅迫前，超氧化物歧化酶（SOD）隨著飼料中低聚木糖水平的升高呈現先升高再下降的趨勢，且250 mg/kg組和500 mg/kg組中的SOD顯著高于對照組和1000 mg/kg組（P＜0.05），且相對對照組分別升高了109.09%和86.49%。脅迫后SOD也呈現先上升后下降的趨勢，250 mg/kg組中的SOD顯著高于對照組（P＜0.05），提高了 67.92%。

氨氮脅迫前后，過氧化氫酶（CAT）和總抗氧化能力（T-AOC）均隨著飼料中低聚木糖的水平升高呈現先升高后下降的趨勢，T-AOC均在500 mg/kg組達到最高，其中脅迫前500 mg/kg組的T-AOC顯著高于對照組 （P＜0.05），提高了74.30%，脅迫后則未出現顯著差異（P＞0.05）。脅迫前250 mg/kg組、500 mg/kg組和1000 mg/kg組CAT顯著高于對照組 （P＜0.05），分別提升了132.23%、139.19%和110.62%，脅迫后250 mg/kg組和500 mg/kg組 CAT顯著高于對照組 （P＜0.05），分別提升了37.08%和36.67%。

脅迫前，多酚氧化酶（PPO）呈現先上升后下降的趨勢，500 mg/kg組PPO顯著高于其他組（P＜0.05），相對對照組提升了147.47%；脅迫后PPO則呈現上升趨勢，500 mg/kg組和1000 mg/kg組中PPO顯著高于對照組（P＜0.05），分別提升了80.28%和86.39%。

圖1 不同水平低聚木糖對脅迫前后凡納濱對蝦血清 SOD、CAT、T-AOC、PPO及MDA含量的影響

脅迫前后，MDA含量隨著低聚木糖水平的升高呈現先升后下降的趨勢，差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦血清免疫能力的影響 如圖2所示，脅迫前ACP和AKP均呈現先上升再下降后上升的趨勢，均在250 mg/kg組達到最高，但差異并不顯著（P＞0.05）。脅迫后AKP呈現先上升后下降的趨勢，在500 mg/kg組達到最高 （P＞0.05）；ACP則呈現上升趨勢，在1000 mg/kg組達到最高（P ＞ 0.05）。

圖2 不同水平低聚木糖對脅迫前后凡納濱對蝦血清AKP、ACP和LZM的影響

脅迫前后，LZM均呈現先上升后下降的趨勢，且均在500 mg/kg組達到最高，但組間差異并不顯著（P ＞ 0.05）。

3 討論

3.1 不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦生長性能的影響 熊沈學（2005）發現，當飼料中低聚木糖水平為0.01%時可明顯提高異育銀鯽的生長性能（P＜0.05），但當添加水平增加到0.02%時，異育銀鯽的增重率與對照組之間未出現顯著差異。褚武英等（2008）在草魚飼養的試驗中發現，當低聚木糖添加水平為0.04%時，草魚增重率顯著提高（P＜0.05），但當添加水平為0.06%時則產生了明顯的抑制作用。研究結果揭示，過高水平的低聚木糖，可能會抑制腸道內的有益菌活性，導致對蝦從腸道吸收的營養物質減少，生長速度相應減慢，從而導致對蝦增重率和特定生長率下降 （熊沈學，2005； 劉棟輝等，2002；Song等，1997；Verlhac 等，1996）。本試驗結果表明，增重率和特定生長率均在添加水平較低的250 mg/kg組達到最高 （P＞0.05），在添加水平最高的1000 mg/kg組中，增重率和特定生長率低于對照組。飼料轉化率與之相反。但在本試驗條件下，不同水平低聚木糖并未對增重率、特定生長率和飼料轉化率產生顯著作用，這可能與試驗周期、試驗對象大小等有關，需進行進一步研究。

3.2 不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦血清抗氧化能力的影響 在一個完整的抗氧化體系中，SOD、CAT作為第一道防線和末端氧化酶，二者活力水平是判斷機體抗氧化應激能力的重要指標（孫金輝等，2017；胡毅，2007；張學明等，1998）。相關研究表明，飼料中添加適宜水平的低聚木糖能夠有效提高奧尼羅非魚和草魚等水產動物機體的抗氧化能力（張榮斌等，2011；龐麗嬌等，2010）。在本研究中，當飼料中低聚木糖添加水平為250 mg/kg和500 mg/kg時，對蝦血清中SOD和CAT活力顯著高于其他兩組。從抗氧化酶的作用機制來看，適宜水平的低聚木糖能夠提升SOD催化分解超氧陰離子以及CAT及時清除組織器官中H2O2的能力，從而減少氧自由基對機體的損害，增強機體抗氧化能力。總抗氧化能力（T-AOC）可以反映出生物體清除氧自由基（ROS）的能力，亦可以較準確的測定出其含量（王一娟等，2011）。本試驗中，低聚木糖添加量為500 mg/kg時，T-AOC顯著高于對照組。綜上，低聚木糖添加水平為250~500mg/kg時能夠增強對蝦機體的抗氧化能力，但當低聚木糖水平過高時則會對機體抗氧化能力產生一定的抑制作用。

當機體存在大量氧自由基時，細胞氧化損害及脂質過氧化反應隨之增多，而脂質過氧化反應的最終產物MDA在一定程度上可以反映細胞損傷程度（陳曉瑛等，2014）。在本試驗中，血清中SOD和CAT活力、T-AOC含量與MDA含量呈現出較為明顯的負相關性，即對照組以及1000 mg/kg低聚木糖組中對蝦血清中MDA含量顯著低于其余兩組，也間接反映適宜水平的低聚木糖能有效提升機體的抗氧化能力，這與胡曉偉等（2018）對花鱸（Lateolabrax japonicus）的研究結果相一致。

3.3 不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦血清免疫力的影響 ACP活性提高，有利于生物體細胞物質代謝，促進生長，提高非特異性免疫力。在酸性條件下，ACP可以通過水解作用，將帶有磷酸酯的異物降解（熊沈學，2005）。本試驗條件下，飼料中添加不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦血清ACP活性有提升作用，但組間差異并不顯著。劉巖等（2000）對對蝦注射1.0%聚甘露糖醛酸多糖進行免疫刺激發現，肝胰腺ACP活性顯著提升。王秀華等（2004）研究表示，對蝦飼料中添加肽聚糖可以提高對蝦血清中ACP活力。

本試驗結果顯示，飼料中添加適量水平低聚木糖對凡納濱對蝦血清中AKP活力有一定提升作用，這與吳陽等（2013）對團頭魴及胡曉偉等（2018）對花鱸幼魚的研究結果類似。上述研究結果顯示，低聚木糖對水產動物血清AKP活力有一定提升作用，但均未產生顯著作用，且飼料中低聚木糖水平過量可能會產生抑制作用。這可能是由于適量的低聚木糖促進了腸道中有益菌的增殖，進而促進了血清AKP的合成，但過量低聚木糖則抑制了有益菌的繁殖，相應的降低了AKP活力。

LZM可催化糖苷鍵水解，使細菌細胞壁破裂，細菌死亡，是水產動物體內的重要非特異性防御因子之一，可以體現病原菌以及其他的環境因子對水產動物健康的影響。本試驗條件下，飼料中不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦血清LZM均有提升作用，其中，以500 mg/kg組LZM活力最高，這與熊沈學 （2005）在低聚木糖對異育銀鯽血清LZM活力影響的試驗中結果類似，何四旺等（2003）在低聚異麥芽糖對羅非魚血清LZM活力影響的試驗中也顯示出類似情況。低聚木糖添加水平過高，溶菌酶活力反而下降，可能是由于過量低聚木糖抑制了腸道部分有益菌增殖，而該菌可提高血清溶菌酶活力。

3.4 不同水平低聚木糖對凡納濱對蝦抗氨氮脅迫能力的影響 氨氮是指水體中以游離氨（NH3）和銨離子（NH4+）形式存在的氮，其中對水產動物有危害的主要是游離氨。有研究認為，游離氨為親脂性分子，可以穿過脂質生物膜進入生物體內，對水生動物的表皮細胞造成傷害，從而降低水產動物的免疫力（余瑞蘭等，1999）。本研究發現，氨氮脅迫后，凡納濱對蝦血清中SOD活力高于脅迫前，說明短期氨氮脅迫誘導了SOD的表達。有研究發現，短期氨氮脅迫可明顯提高中華絨螯蟹、克氏原螯蝦以及日本沼蝦SOD活力 （孔友琴等，2017；蘆光宇，2012；Hong 等，2007）。 這可能是因為短期氨氮脅迫后，添加低聚木糖會對SOD的表達產生一定的短時刺激興奮效應（Stebbing，1982），提高SOD活力，從而提高機體應對脅迫的能力。同時，氨氮脅迫并未對凡納濱對蝦血清其他抗氧化酶活力產生明顯影響。綜上，飼料中添加低聚木糖可提高凡納濱對蝦抗氨氮脅迫能力，但其具體作用機理還需進一步探討研究。

4 結論

本試驗結果表明，飼料中低聚木糖添加水平為250~500 mg/kg時可以提高凡納濱對蝦的生長性能、免疫力及抗氨氮脅迫能力。