口腔鱗狀細胞癌患者血漿lncRNAs差異表達譜的初步研究*

王 璇 賈洪誠 孫 正

口腔鱗狀細胞癌(oral squamouscell carcinoma，OSCC)占口腔癌90%以上，發病率和死亡率較高，全世界每年新發病例超過27.5萬，我國OSCC發病率也同樣很高，每年新發病例11900例，約5000人死于OSCC[1-4]。OSCC是一個多基因、多因子互相作用的復雜過程，目前還缺少有效的、微創的監測手段。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子，起初被認為是基因組轉錄的“噪音”[5]。然而，近年來的研究表明，lncRNAs參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程，可以在表觀遺傳學水平、轉錄及轉錄后水平等在多種層面上調控基因的表達[6]。轉錄譜分析顯示lncRNAs在人類腫瘤中的表達明顯異常，和腫瘤的分子病理機制有關，lncRNA具有腫瘤發生、發展的調節因子功能，有望成為腫瘤的潛在標志物和治療靶標。然而，OSCC患者血漿中lncRNA表達譜尚未見報道。本研究應用lncRNA芯片技術，比較OSCC患者和健康者血漿中lncRNA的差異表達情況，運用生物信息學方法分析靶基因的生物學效應，以探討OSCC相關lncRNAs與OSCC發生、發展的關系，以期為OSCC的早期診斷和預后判斷提供理論基礎。

1.材料與方法

1.1 研究樣本 于2013年12月至2015年5月間在首都醫科大學附屬北京口腔醫院黏膜科和口腔外科收集入組，簽署知情同意書，一般狀況見表1。所有受試者均未行放化療，無其他系統性病史，各重要器官功能無異常。本研究項目經首都醫科大學附屬北京口腔醫院倫理委員會批準。于清晨空腹采集血漿，用紫帽采血管(EDTA抗凝)采取靜脈血10ml，4℃、1000×g離心10min，分離血漿和細胞組分，將采集好的血漿轉移至單獨的EP凍存管，按照每400～500ul/管分裝好，于-80℃凍存、待檢。

表1 研究人群的一般狀況

1.2 芯片雜交實驗 研究所用芯片為Arraystar人類lncRNA芯片(v4.0)，由上海康成生物技術有限公司協助完成。按照Arraystar LncRNA Array Protocol標準流程進行芯片雜交實驗。完成雜交的芯片采用Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)進行掃描，使用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1)獲得芯片圖，并讀值，得到原始數據。

1.3 數據處理 使用GeneSpring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)對原始數據進行Quantile標準化和隨后的數據處理。原始數據標準化后經過篩選高質量探針(某探針在6個樣品中至少有3個被標記為Present或Marginal)進行進一步分析。差異表達lncRNAs或DEGs通過P-value/FDR篩選，P值利用t-test計算，并根據Benjamini Hochberg FDR方法進行修正(即FDR值)，篩選標準為|Fold change|≥2.0且FDR＜0.05。DEGs進行GO和KEGG分析，使用編寫腳本進行層次聚類和關聯分析。

1.4 Real-time PCR驗證 根據芯片結果，選取14條lncRNAs做芯片同源血漿樣本PCR驗證。Realtime PCR反應體系為：5μl 2×Master Mix、0.5μl 10uM的 PCR特異引物F、0.5μl 10uM 的PCR特異引物R、加水至總體積為8μl；將8ul混合液加到384-PCR板對應的每個孔中，再加入對應的2μl cDNA。PCR儀為ViiA 7 Real-time PCR System(Applied Biosystems)，反應程序為：95℃10min；共40個PCR 循環(95℃10s，60℃60s，熒光檢測1次)。引物設計軟件為Primer 5.0。使用管家基因β-actin作為內參。組間比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2.結果

2.1 血漿總RNA放大和標記情況 血漿總RNA放大和標記結果見表2。

表2 血漿總RNA的熒光標記放大結果

2.2 芯片雜交圖像 芯片信號清晰，無邊緣化效應，證明芯片結果可用。具體見圖1～圖6。

圖1 (H5)

圖2 (X474)

圖3 (H8)

圖4 (X574)

圖5 (H13)

圖6 (X602)

2.3 箱體圖分析 由圖7、圖8可以觀察到芯片掃描后各個樣本熒光密度值標準化之后的分布，其平均值基本保持在同一水平，進一步驗證了芯片掃描讀數的穩定件。

圖8 Box Plot-mRNA

圖7 Box Plot-lncRNA

2.4 差異表達的lncRNAs和mRNAs OSCC組和健康對照組相比，有6606個lncRNAs表達有差異，其中上調3511個，下調3095個；同時檢測到有4196個mRNAs表達有差異，其中上調1766個，下調2430個。

2.5 聚類分析 聚類圖橫軸代表樣本聚類，縱軸代表基因聚類，紅色代表高的相對表達量，綠色代表低的相對表達量(圖9，圖10)。可見，這些差異表達的lncRNAs和mRNAs可以很好的將OSCC和健康組區分開來。

圖10 差異表達mRNAs的聚類分析

2.6 DEGs的GO分析 對差異lncRNAs的靶基因進行Gene Ontology的生物學的分類，可以獲得lncRNAs靶基因對應的顯著性功能，從而了解lncRNAs的功能。表達上調的mMRAs共富集到266條BP術語、33條CC術語、57條MF術語；表達下調的mRNAs共富集到266條BP術語、90條CC術語、55條MF術語。差異表達mRNAs富集的GO術語差異顯著性(按照P值排序)前十者見表3、4。

表3 表達上調mRNAs富集的GO生物學術語(前10個)

續表

2.7 DEGs的KEGG生物學通路分析 京都大學基因和基因組百科全書數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，KEGG)，是系統分析基因功能的數據庫。對差異表達mRNAs數據進行KEGG生物學通路分析(Pathway analysis)分析，上調的mRNAs在8條基因通路中富集程度比較高(表5)，下調的mRNAs在14條基因通路中富集程度比較高(表6)。

2.8 待測基因以內參校正后的相對表達量比較與對照組相比，OSCC組14個lncRNAs均呈差異表達，除了NR_024050下調(無統計學意義)外，其余13個lncRNAs均上調，有9個lncRNAs的差異倍數具有統計學意義(表7)。這與lncRNA芯片結果基本一致。

表4 表達下調mRNAs富集的GO生物學術語(前10個)

續表

表5 表達上調mRNAs富集的生物學通路

表6 表達下調mRNAs富集的生物學通路

表7 14個lncRNAs相對表達量及差異表達倍數(OSCC/H)

續表

3.討論

雖然lncRNA芯片檢測信息量大，但篩選出來的lncRNA質量并不很穩定，缺乏可重復性，芯片上所有探針雜交條件的一致性限定了雜交的特異度，導致結果的假陽性率較高。血清/血漿中RNA含量低于分光光度計測量的下限，無法準確測量，因此無法通過測量OD值或比值來判斷純度或濃度，同時無細胞的血清/血漿中RNA主要是小RNA，傳統的凝膠電泳檢測RNA完整性也不適于血清/血漿中RNA。為了避免芯片篩選出現假陽性，驗證芯片結果的可信度，作為芯片實驗反向質控步驟，本研究利用PCR方法對芯片同源血漿樣本做了驗證。結果證明，血漿樣本質量完好，lncRNA量充足。基因表達的差異方向與芯片實驗結果一致，進一步確認這些基因在OSCC血漿中差異表達，同時也說明芯片實驗結果可信。

大量研究證明lncRNA表達失調可以作為腫瘤診斷和預后判斷的生物標志物。比如MALAT1可作為前列腺癌早期診斷的標志物[7]，HOTAIR表達上調提示結腸癌和乳腺癌預后差[8]，GAS5表達下調提示胃癌預后差[9]，HULC在肝癌中表達異常[10]等。本研究發現，OSCC血漿中有6606個lncRNAs和4196個mRNAs表達有顯著性差異。聚類分析表明，這些DEGs對樣本有很好的聚類作用。

GO分析顯示，有532個DEGs在生物學進程方面富集程度較高，123個DEGs在細胞組件方面富集度較高，112個DEGs在分子功能方面富集度較高。這些功能涉及到腫瘤細胞的生長、分化、代謝、凋亡、信號傳導等整個細胞周期過程，由此可見機體調控機制的復雜性，這些DEGs可能通過調節細胞周期的各個環節來參與細胞的轉化和惡變過程，而這些DEGs以及它們參與調控的路徑均有可能成為OSCC分子診斷和基因干預治療的新靶點。

我們進一步對DEGs進行KEGG Pathway分析，獲得了DEGs所參與的細胞生命活動調節通路。上調mRNAs參與了8條通路，下調mRNAs參與了14條通路。這些通路大部分都包含有炎癥、免疫、代謝等相關因子和路徑。比如，RIG-I樣受體信號通路中包含了泛素介導的蛋白水解、MAPK信號通路等。HIF-1信號通路包含mTOR、MAPK、VEGF和PI3K-Akt信號通路，亨廷頓病通路中包含p53信號通路。諸多證據表明PI3KAkt信號通路在腫瘤的進展中起著重要的作用[11-13]，這條通路在原發性腫瘤和繼發性腫瘤中表達均明顯增高[12，14]。維甲酸誘導基因I樣受體(Retinoic acidinduciblegene I，RIG-I)是機體識別病毒的主要模式識別受體之一，RIG-I基因可能具有腫瘤抑制劑作用[15]，RIG-I信號通路異常可導致炎癥、免疫疾病和腫瘤發生，RIG-I可以通過下調基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 9，MMP9)來抑制肝癌細胞的轉移和侵襲[16]，RIG-I也可通過調節Akt激活，對鱗癌細胞產生雙重作用：低劑量的病毒雙鏈RNA活化RIG-I，促進了細胞的生長，而高劑量的病毒活化RIG-I導致細胞凋亡，這些發現提示雙鏈RNA介導的RIG-I激活在頭頸部鱗癌的發生發展中具有潛在的關鍵作用[17]。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路調節細胞增殖、分化、生存、凋亡等，與腫瘤的增殖、遷移、侵襲等生物學行為密切相關[18]。

總之，OSCC患者血漿lncRNA表達譜發生了顯著變化，DEGs功能涉及細胞的生長、分化、凋亡、信號傳導等整個細胞周期過程，涉及到的通路包括：信號傳導通路、炎癥相關通路、代謝相關通路、細胞周期等。眾多基因及通路組成復雜的調控網絡參與細胞的轉化和惡變過程。LncRNA是當代表觀遺傳學中最有潛力的基因表達調控模式[19]，對lncRNA表達譜的研究及相關生物信息學分析有助于OSCC治療靶點的鑒定和生物標志物的發現。在后續研究中需要進一步擴大樣本，深入研究證實結論的可靠性并篩選出在OSCC中具有進一步研究價值的lncRNAs。