菌酶協同發酵水解大米蛋白ACE抑制肽及其活性的研究

鄒俊哲，林凱，譙飛，楊旭，劉紅彥，楊艷艷，劉漢民，韓雪，*，張蘭威，5，*

（1.中國海洋大學基礎教學中心，山東青島266003；2.哈爾濱工業大學化工與化學學院，黑龍江哈爾濱150090；3.哈爾濱市食品工業研究所有限公司，黑龍江哈爾濱150090；4.中恩（天津）營養科技有限公司，天津300000；5.華羚生物技術研究中心，甘肅蘭州730000）

目前，中國腎病患者已超過一億人，腎臟作為人體內蛋白重吸收的主要器官，一旦受到損傷或病變后，日常蛋白的攝入尤其是植物蛋白就會對腎病患者造成代謝負擔。低蛋白飲食可以減輕腎臟負擔并且減緩腎臟病變的幾率[1]。長久以來，大米已成為中國人餐桌上的主食，但腎病患者因受到疾病的困擾，不能過多的攝入大米蛋白[2]，進而嚴重影響了腎病患者的生活品質、心理健康和社會關系等[3]。大米中含有約為7.5%的大米蛋白，在制備低蛋白大米時，大米蛋白會以蛋白水解物形式轉入到脫除液中，脫除液的排放會對環境造成污染。然而，脫除液中的蛋白及多肽是一種可利用資源，因此有效的利用大米蛋白脫除液，能夠實現其廢物利用并增加其附加值。

多種蛋白序列中均包含有血管緊張素I 結構類似的多肽序列。目前，利用各種蛋白酶對油菜籽蛋白[4]、大豆蛋白[5]和蘑菇[6]等不同蛋白進行水解，分離純化出了多種具有血管緊張素轉換酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制活性的多肽，并且具有良好的降壓活性。有研究利用乳酸桿菌繼續處理經蛋白酶脫蛋白后的大米，但研究發現乳酸菌并沒有進一步脫除大米蛋白[7]。因此，利用菌酶組合脫除大米蛋白時，應考慮使用何種蛋白酶和菌進行組合及菌酶脫蛋白的先后順序等影響因素。近年來，利用食源性蛋白制備ACE 抑制肽在治療高血壓方面已成為研究熱點[8]。本文主要目的是考察植物乳桿菌2-18 及枯草芽孢桿菌Y、枯草芽孢桿菌Y4-2 和蛋白酶聯合使用對大米中大米蛋白脫除率的影響，同時考察了大米蛋白脫除液的ACE 抑制活性，為大米蛋白的利用提供試驗方法并且奠定理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

試驗用大米由天津市寶坻區喜旺米加工有限公司提供；枯草芽孢桿菌Y（Bacillus subtilisY）、枯草芽孢桿菌Y4-2（Bacillus subtilisY4-2）由天然發酵的納豆中分離獲得，植物乳桿菌2-18（Lactobacillus plantarum2-18）由江米發酵酒中分離獲得，貯藏于哈爾濱工業大學乳品科學實驗室。

胃蛋白酶（800 U/mg）、ACE（1 UN）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸水合物（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、Leu-Leu（色譜純）：美國Sigma 公司，風味蛋白酶、菠蘿蛋白酶（500 U/mg）、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶（200 U/mg）：諾維信（中國）生物技術有限公司；乙酸乙酯（分析純）：天津科密歐試劑有限公司；細胞色素C、抑肽酶、血管緊張素II、氧化型谷胱甘肽（色譜純）：阿拉丁試劑有限公司。

3-30K 高速冷凍離心機：美國Sigma 公司；5BG 生物發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；Millipore8400 超濾杯：美國密理博公司；L-8800 氨基酸自動分析儀：日本日立公司；UV-5100 分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.2 菌體在大米發酵體系中生長曲線的測定

發酵前Bacillus subtilisY、Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 分別在MRS 液體培養基中進行活化，然后以3%（體積分數）接種量接種于大米發酵體系中培養10 h。Lactobacillus plantarum2-18培養溫度為40 ℃，Bacillus subtilisY、Bacillus subtilisY4-2 培養溫度為37 ℃。分別培養到2、4、6、8、10 h 時，分別吸取1 mL 發酵液，經稀釋后涂布于MRS 固體培養基上，37 ℃培養48 h 后進行菌落計數統計，繪制菌體在大米發酵體系中的生長曲線。

1.3 菌體產蛋白酶酶活的測定

菌體培養過程中分別在特定時間（2、4、6、8、10 h）收集培養液進行菌體產蛋白酶酶活的測定。首先，將培養液于4 000 r/min 離心5 min 去除菌體等雜質，取上清液。然后，將培養液稀釋一定倍數后，按照He 等測定酶活方法測定3 株菌產蛋白酶的酶活力[9]。

1.4 菌發酵大米蛋白水解率的測定

將大米洗滌后加入等量的去離子水（1∶1，kg/kg），預熱到相應的發酵溫度，Bacillus subtilisY，Bacillus subtilisY4-2 發酵溫度為37 ℃，Lactobacillus plantarum2-18 發酵溫度為40 ℃。Bacillus subtilisY、Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 的接種量為5%（mL/L）。在115 r/min 振蕩條件下發酵9 h，過濾獲得濾液。用去離子水清洗發酵后的大米，清洗后的大米于120 ℃下烘干6 h，得到脫蛋白大米。參考Guo等的方法使用凱氏定氮測定大米的蛋白脫除率[10]，同時提取大米蛋白發酵液進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳分析[11]。

1.5 菌酶組合發酵水解大米蛋白

選取堿性蛋白酶（alcelase，A）、酸性蛋白酶（acid protease,Ac）、風味蛋白酶（flavourzyme，F）、菠蘿蛋白酶（bromelain，B）、胰蛋白酶 （trypsin，T）和胃蛋白酶（pepsin，P）結合Bacillus subtilisY、Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 進行菌酶組合發酵水解大米蛋白，酶反應最適條件如表1所示。

表1 蛋白酶最適酶解條件Table 1 Optimized parameters for the hydrolysis of enzymes

菌酶組合分別為Y+B/F+A、Y+B/F+Ac/P、Y4-2+B/F+A、Y4-2+B/F+Ac/P、2-18+Ac/P+B/F 分步脫除大米蛋白。以2-18+Ac/P+B/F 組合分步脫除大米蛋白為例：將Lactobacillus plantarum2-18 以5%（L/L）接種于大米發酵液中，于40 ℃115 r/min 條件下發酵9 h，過濾收集濾液，用去離子水清洗經Lactobacillus plantarum2-18 發酵的大米；調整pH 值至2.5，加入0.3%（E/S）胃蛋白酶/酸性蛋白酶，控制溫度為40 ℃30 r/min 條件下發酵18 h，過濾收集濾液，用等量蒸餾水清洗大米；調整大米發酵液pH 值至6.8，溫度為45 ℃，加入0.3%（E/S）風味蛋白酶/菠蘿蛋白酶，于45 ℃30 r/min條件下發酵18 h，過濾收集過濾液，用蒸餾水清洗大米。同時測定大米蛋白脫除率。將Lactobacillus plantarum2-18 發酵液與2 次蛋白酶酶解液收集合并，經8 000 r/min 離心10 min，去除菌體和顆粒等雜質。最后經冷凍干燥后，將樣品置于-20 ℃備用。

1.6 大米蛋白水解液氨基酸分析

取大米蛋白水解樣品（100 mg）于樣品管中，向樣品管中加入2 mL 濃HCl（6.0 mol/L），樣品管于真空條件下110 ℃水解22 h。待溫度降至室溫后，向樣品管中加入10 mL NaOH（6.0 mol/L），最后使用去離子水定容至25 mL。樣品溶液與HCl（0.02 mol/L）以1∶1（mL/mL）混合，經0.22 μm 濾膜過濾后，使用氨基酸自動分析儀進行氨基酸組成分析。氨基酸檢測條件：標準分析柱4.6 mm×60.0 mm，反應柱溫度為57.0 ℃，反應器溫度為136 ℃。必需氨基酸（essential amino acid，EAA）評價：采用氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）系數法對大米蛋白水解肽進行營養評價，計算公式如下所示：

1.7 大米蛋白水解液中多肽分子量分布的測定

樣品處理：將大米蛋白發酵水解液經冷凍干燥后，用流動相配制成1 g/L 的溶液，然后經0.22 μm濾膜過濾后，采用體積排阻色譜分析大米蛋白發酵水解液多肽分子量的分布。分子量分布曲線利用含有Leu-Leu（分子量：226 Da）、氧化型谷胱甘肽（分子量：615 Da）、血管緊張素Ⅱ（分子量：1 046 Da）、抑肽酶（分子量：6 500 Da）和細胞色素C（分子量：12 500 Da）的混合標準品進行繪制。

體積排阻色譜條件：色譜柱為TSK gel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）凝膠柱；流動相：乙腈∶水∶三氟乙酸（mL/mL/mL）=10∶90∶0.1；檢測波長為220 nm；泵流速設為0.5 mL/min；柱溫箱溫度為30 ℃；進樣體積為10 μL[12]。

1.8 大米蛋白發酵水解液ACE抑制活性的測定

參考Lin 等[13]的方法測定ACE 抑制率測：取25 μL樣品加入125 μL 的馬尿酰組氨酸亮氨酸（N-hippuril-L-histidy-L-leucine，HHL），于37 ℃水浴預熱5 min，加入20 μL 的ACE（0.1 U/mL）。將上述混合溶液置于37 ℃水浴孵育1 h，然后加入350 μL HCl（1 mol/L）用于終止反應。向試管中加入1.7 mL 乙酸乙酯用于萃取生成的馬尿酸，將上述溶液充分旋渦振蕩15 s 后，4 000 r/min 離心5 min，靜置放置分層后，取上層清液1 mL 置于120 ℃干燥箱內烘干，冷卻后加入1 mL 去離子水溶解，超聲5 min 后于228 nm 處測定吸光值。ACE 抑制活性通過下式計算：

式中：A為空白組（即將25 μL 樣品換成緩沖液）吸光值；B為樣品組吸光值；C為ACE 失活組（即在加入ACE 之前先加入350 μL HCl，使ACE 失活）吸光值。

1.9 數據分析

本研究每組試驗均重復3 次。利用SPSS 軟件對試驗數據進行統計分析，采用單因素方差分析（oneway ANOVA）中Duncan＇s 法進行分析，顯著性水平設定為P＜0.05。

2 結果與討論

2.1 Bacillus subtilis Y、Bacillus subtilis Y4-2和Lactobacillus plantarum 2-18在大米發酵液中生長曲線分析

通?？疾炀w在基質中的生長曲線用于分析菌體生長情況。本試驗菌體發酵大米蛋白液較為渾濁，因此采用平板計數法對Bacillus subtilis Y、Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 在大米發酵液中的生長情況進行分析。將不同時間的發酵液經平板計數，結果如圖1所示。

圖1 B.subtilis Y、B.subtilis Y4-2和L.plantarum 2-18在大米發酵液中的生長曲線Fig.1 Growth curve of B.subtilis Y，B.subtilis Y4-2 和L.plantarum 2-18 in rice

由圖1結果可知，3 株菌在大米發酵過程中均能夠較好的生長。Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 經過8 h 的生長，活菌數均能夠達到108CFU/mL 數量級，生長優于Bacillus subtilisY。

2.2 Bacillus subtilis Y、Bacillus subtilis Y4-2和Lactobacillusplantarum 2-18在大米發酵液中蛋白酶活的分析

圖2為Bacillus subtilisY，Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 在不同發酵時間，大米發酵液中蛋白酶酶活的檢測結果。

圖2 B.subtilis Y、B.subtilis Y4-2和L.plantarum 2-18在大米發酵液中蛋白酶酶活Fig.2 The enzyme activity of Bacillus subtilis Y，B.subtilis Y4-2 and L.plantarum 2-18 in the rice fermentation liquid

由結果可知，Lactobacillus plantarum2-18 產生的蛋白酶酶活高于Bacillus subtilisY 和Bacillus subtilisY4-2 產生的蛋白酶酶活，同時芽孢桿菌產生的蛋白酶酶活具有顯著差異。Bacillus subtilisY、Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 在發酵6 h 后酶活的增加均趨于平緩，Bacillus subtilisY 和Bacillus subtilisY4-2 的酶活分別為（30.6±2.0）U/mL 和（59.7±4.7）U/mL，Lactobacillus plantarum2-18 的 酶 活 為（79.9±6.5）U/mL。因此，考慮到3 株菌產生的蛋白酶酶活力，選擇產蛋白酶酶活相對穩定的時間（9 h）進行后續實驗。

2.3 Bacillus subtilis Y、Bacillus subtilis Y4-2和Lactobacillus plantarum 2-18對大米蛋白脫除率的分析

為了考察3 株菌對大米蛋白的脫除能力，本試驗研究了經Bacillus subtilisY，Bacillus subtilisY4-2 和Lactobacillus plantarum2-18 發酵后大米蛋白電泳圖及其蛋白脫除率，圖3為脫蛋白大米蛋白電泳圖，圖4為3 株菌對大米蛋白脫除率的影響。

圖3 大米經B.subtilis Y、B.subtilis Y4-2和L.plantarum 2-18發酵液電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of fermentation liquid produced by B.subtilis Y，B.subtilis Y4-2 and L.plantarum 2-18

圖4 大米經B.subtilis Y、B.subtilis Y4-2和L.plantarum 2-18發酵后蛋白脫除率Fig.4 Protein removal rate of fermentation liquid produced by B.subtilis Y，B.subtilis Y4-2 and L.plantarum 2-18

通過SDS-PAGE 試驗發現，大米蛋白發酵液電泳條帶主要分布在10、20、35、50 kDa 附近區域。通過對比經3 株菌發酵后的大米蛋白水解產物電泳圖可以發現，其中Lactobacillus plantarum2-18 發酵后的大米蛋白顯著減少。通過考察3 株菌對大米蛋白脫除率的影響（圖4）發現，Bacillus subtilisY 和Bacillus subtilisY4-2 水解大米蛋白的能力較弱，分別為（22.35±1.30）%和（19.56±1.60）%，Lactobacillus plantarum2-18 的蛋白脫除率可達到（37.68±1.70）%，該結果與電泳試驗結果一致。與Bacillus subtilisY 和Bacillus subtilisY4-2相比，Lactobacillus plantarum2-18 具有更強的水解大米蛋白能力。

2.4 菌酶組合發酵水解對大米蛋白效果的分析

試驗選取了如圖5所述的菌酶組合，考察了不同菌酶組合對大米蛋白脫除率的影響。

圖5 不同菌酶組合對大米脫除率的影響Fig.5 Determination of protein removal rate by different combinations of bacterium with enzymes

通過測定不同菌酶組合對大米蛋白的脫除率可以發現，相比于菌體單獨作用大米進行脫蛋白而言，菌酶組合能夠更有效的增加大米蛋白的脫除率。當菌體單獨進行大米脫蛋白試驗時，Lactobacillus plantarum2-18 的大米蛋白脫除率僅為（37.68±1.70）%，而當Lactobacillus plantarum2-18 與胃蛋白酶/酸性蛋白酶和菠蘿蛋白酶/風味蛋白酶共同處理大米進行脫蛋白時，大米蛋白脫除率可達（91.32±1.60）%。因此，將進一步考察Lactobacillus plantarum2-18+風味蛋白酶/菠蘿蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶組合得到的大米蛋白發酵水解液的相關性質。

2.5 菌酶組合發酵水解大米蛋白液氨基酸分析及其營養學評價

對Lactobacillus plantarum2-18+胃蛋白酶/酸性蛋白酶+菠蘿蛋白酶/風味蛋白酶組合進行大米脫蛋白獲得的大米蛋白發酵水解液進行了氨基酸組成成分分析，見表2。

表2 大米蛋白發酵水解液氨基酸組成及RAA、RC和ARC值Table 2 The amino acids composition of removal liquid of rice and its RAA，RC，SRC values

通過對Lactobacillus plantarum2-18+胃蛋白酶/酸性蛋白酶+菠蘿蛋白酶/風味蛋白酶組合獲得的大米蛋白發酵水解液進行氨基酸分析，共檢測到17 種氨基酸，其中必需氨基酸（除色氨酸）占39.62%，非必需氨基酸占60.38%。該組合大米蛋白發酵水解液SRC 值為91.05，遠高于豬肉組織（74）和牛肉組織（76）中蛋白的SRC 值。同時，氨基酸組成分析結果可知，含硫氨基酸及芳香族氨基酸和亮氨酸RC 值均高于1，為過剩氨基酸；而賴氨酸為蛋白脫除液中的限制氨基酸，其RC 值為0.6。亞洲人主要攝入的植物蛋白為大米蛋白，相比于其他植物蛋白，大米蛋白富含多種必需氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸等[14-15]。研究表明，大米蛋白具有較低的致敏性，易于腸道消化，可作為嬰兒食用蛋白[16-17]。

2.6 菌酶大米-蛋白發酵水解液肽的分子量分布

利用體積排阻色譜測定了不同標準品（Leu-Leu、氧化型谷胱甘肽、血管緊張素Ⅱ、抑肽酶和細胞色素C）的相對保留時間見圖6，標準物的分子質量與其保留時間的關系見圖7和樣品的體積排阻色譜分布見圖8。

圖6 標準品體積排阻色譜洗脫曲線Fig.6 The size exclusion chromatography of mixed standard subject

圖7 標準物的分子質量對數與其保留時間的關系Fig.7 Relationship of lg（MW）of standard subject and retention time

由圖6可知，不同標準物具有良好的分離度；由圖7可知，分子量的對數（lgMW）對保留時間曲線方程其相關系數R2為0.977，表明該校正曲線具有良好的線性相關；根據圖8獲得體積排阻色譜圖峰保留時間，確定樣品蛋白分子量分布見表3。

表3 大米蛋白肽的分子量分布Table 3 The distribution of molecular weight of peptides

由表3可知，大米蛋白菌酶發酵水解液中蛋白分子量分布范圍為：＜1 000 Da（22.82%）、1 000 Da～1 500 Da（41.66 %）、1 500 Da～3 000 Da（24.34 %）、＞3 000 Da（11.18%）。試驗結果表明，在利用菌酶組合發酵水解大米蛋白的同時，大分子蛋白被水解生成多肽。

圖8 樣品體積排阻色譜譜圖Fig.8 The size exclusion chromatography of sample

2.7 米蛋白菌酶發酵水解液ACE抑制活性分析

Lactobacillus plantarum2-18、胃蛋白酶/酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶/風味蛋白酶及其組合發酵水解大米蛋白液肽分析可知，多肽分子量主要分布在1 000 Da ～3 000 Da 之間，前人研究表明具有ACE 抑制活性的肽分子量通常小于3000 Da[18]，本研究測定了Lactobacillus plantarum2-18、胃蛋白酶/酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶/風味蛋白酶及其組合發酵大米產生的脫蛋白液（＜3 000 Da）的ACE 抑制活性，結果見圖9。

由圖9可知，菌、酶單獨作用時，大米蛋白發酵水解液均具有一定的ACE 抑制活性，其ACE 抑制率分別為 （20.15±3.56）%（Lactobacillus plantarum2-18）、（30.21±2.120）%（酸性蛋白酶/胃蛋白酶）和（24.43±3.21）%（菠蘿蛋白酶/風味蛋白酶）。而當菌酶組合，大米蛋白發酵水解液的ACE 抑制活性顯著升高，經過Lactobacillus plantarum2-18+風味蛋白酶/菠蘿蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶分步脫蛋白得到的大米蛋白發酵水解液ACE 抑制率達到（91.95±1.63）%。利用菌酶組合發酵水解大米蛋白，不僅能夠提升蛋白水解液的生物學功能，同時還能夠降低大米中的蛋白含量使其滿足腎病患者的飲食需求[19-20]。

圖9 不同菌酶組合的發酵水解液的ACE抑制率Fig.9 ACE inhibitory activities of the hydrolysates produced by different combinations of bacterium with enzymes

3 結論

研究利用菌酶單獨或組合方式對大米脫蛋白效果及大米蛋白發酵水解液相關性質進行了研究。Lactobacillus plantarum2-18+風味蛋白酶/菠蘿蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶組合具有良好的大米蛋白脫除效果，蛋白脫除率可達（91.32±1.60）%。通過對該菌酶組合獲得的大米蛋白發酵水解液進行分子量分布分析，確定蛋白肽分子量主要集中于1 000 Da～3 000 Da 之間。對該蛋白發酵水解液進行超濾分級，確定其中小于3 000 Da 蛋白肽的ACE 抑制活性最高，抑制率達（91.95±1.63）%，具有良好的開發前景。