咖啡果皮酵素發酵過程中代謝產物與抗氧化功能評價

陳小偉，范昊安，張婷，崔艷麗，沙如意，*，毛建衛，*

（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，浙江杭州310023；2.浙江大學化學系，浙江杭州310027）

咖啡是世界最受歡迎的三大飲品之一，在我國云南省有廣泛種植，其主要品種為云南小粒咖啡。咖啡豆被外表光滑的咖啡果皮包裹，成熟的咖啡果皮呈深紅色或紫紅色。咖啡果皮中富含花青素[1]，具有抗氧化[2]、保護心臟[3]、抑制癌細胞生長[4]等一系列保健功效。在我國，每年都有大量的咖啡果皮等副產物被丟棄，不僅造成資源的浪費，還導致了環境的污染。

植物酵素最初起源于日本，因其顯著的生理功效受到廣泛關注，近年來也在中國大陸得到廣泛發展。植物酵素是以一種或多種蔬菜、水果和豆谷類、海藻類、藥食兩用本草類等為原料，加（或不加）糖類物質，經加入單種或多種益生菌（或不加菌依靠植物表面的微生物），經過低溫長時間發酵而產生的功能性微生物發酵產品[5-6]。

目前對于植物酵素的研究較多，主要包括發酵工藝[7]、功能性[8]以及發酵過程中代謝產物[9]的研究。植物酵素中成分較多，生物化學反應復雜，發酵過程難以確定。目前，關于不同發酵時間段植物酵素的綜合評價較少，選擇合適的評價方法確定植物酵素發酵狀態尤為關鍵。本研究對咖啡果皮植物酵素發酵過程中代謝產物的變化以及抗氧化性能進行研究，建立了代謝產物與抗氧化指標之間的相關性，利用主成分分析評價不同時間段咖啡果皮酵素的綜合指標，確定咖啡果皮酵素發酵狀態，以期建立一種咖啡果皮酵素綜合指標變化評價方法，為咖啡果皮酵素的精確發酵提供基礎數據；同時對咖啡果皮的高效利用，有效的減少資源的浪費，具有廣泛的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料

咖啡果：云南省保山市小粒咖啡，完全成熟，咖啡果皮呈現深紅色；發酵用糖液：浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室。

1.1.2 試驗試劑

葡萄糖、蒽酮、硫酸、氫氧化鈉、福林酚（10%）、甲醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；α，α-二苯基-β-苦苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；2，2-聯氮基-雙-二胺鹽[2，2'-azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS]、考馬斯亮藍G250：上海長哲生物科技有限公司；乙醇：優級純，上海阿拉丁試劑有限公司；醋酸、乳酸：標準品，中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 試驗設備

Allegra X-12R 離心機：貝克曼庫爾特有限公司；PTX-FA210 型電子天平：福州華志科學儀器有限公司；XMTD-204 數顯式電熱恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；Waters e2695 高效液相色譜（配備Waters 2998 二極管陣列紫外檢測器）：Waters 公司；UV-5500 PC 型紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；GC2010/HSS 86.50 島津GC2010 氣相色譜儀+DANI 頂空進樣器：日立公司；PHS-3C 酸度計：上海佑科儀器儀表有限公司；SpectraMax iD3 多功能酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 咖啡果皮酵素的制備

取滅菌、冷卻后的無菌水輕輕沖洗帶果皮咖啡表面，自然瀝干后剝下果皮（保留剝皮過程中的汁水），整個過程在無菌環境下進行。按咖啡果皮與糖液3∶4（質量比）加入經高壓蒸汽滅菌冷卻后的發酵罐中，于（25±5）℃條件下避光發酵，定期吸取一定量的發酵液，于6 000 r/min 條件下離心15 min，取上層清液檢測。

1.2.2 總糖含量的測定

采用蒽酮-硫酸法[10]測定咖啡果皮酵素發酵過程中總糖含量變化。將樣品稀釋5 000 倍，取稀釋后的發酵液200 μL 于2 mL 離心管中，在冰浴條件下向試管中加入0.2 g/100 mL 的蒽酮-硫酸溶液800 μL，冷卻后振蕩混勻。以水為空白對照，沸水浴中反應10 min 后于冰水浴中再次冷卻，取100 μL 于96 孔板中，于620 nm處測吸光度。并按照10、20、30、40、60、80 μg/mL 配制葡萄糖標準溶液，取200 μL 標準溶液按上述方法繪制葡萄糖標準曲線。

1.2.3 總酸含量和pH 值的測定

參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》，在此基礎上有所調整，取離心后的咖啡果皮酵素1 mL，加水定容至50 mL，取一定體積的上述稀釋液于150 mL錐形瓶中，以0.002 mol/L 的NaOH 水溶液為滴定液，酚酞試劑作為指示劑。發酵液pH 值的測定依據GB 10468-1989《水果和蔬菜產品pH 值的測定方法》，取離心后的發酵液直接檢測。

1.2.4 醋酸和乳酸含量的測定

色譜條件：色譜柱為Agilent TC C18 柱（250 mm×4.6 mm i.d，5 μm）；流動相：甲醇：KH2PO4緩沖液（pH 2.7）=2∶98（體積比）；流速：1 mL/min；檢測波長210 nm，柱溫25 ℃[11]。

待測樣品制備：取離心好的發酵液上清液，加入0.01 mol/L KH2PO4緩沖液（pH 2.7）稀釋5 倍，經過0.22 μm 微孔濾膜過濾待測。

1.2.5 乙醇含量的測定

以叔丁醇為內標，采用GB 5009.225-2016《食品安全國家標準酒中乙醇含量的測定》第三法進行測定。

自動頂空條件[12]：爐溫85 ℃，平衡時間40 min；進樣閥溫度105 ℃；傳輸線溫度110 ℃。氣相色譜條件：色譜柱：RTX-5 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫40 ℃，平衡時間3.0 min，10 ℃/min 升溫至180 ℃，保溫5 min；進樣口/氣化室溫度：200 ℃；分流比30∶1；檢測器溫度250 ℃。

1.2.6 總酚含量的測定

采用福林酚法測定咖啡果皮酵素發酵液中總酚含量的變化[13]。取10μL 不同發酵時間的發酵液于10mL離心管，加水稀釋至500 μL，加入10%福林酚水溶液（體積比）2.5 mL，充分振蕩混勻，常溫避光靜置3 min。反應結束后加入7.5%Na2CO3水溶液2 mL，振蕩混勻。25 ℃，120 r/min，避光反應1 h，以0.5 mL 去離子水按上述方法進行空白調零，765 nm 下測定吸光度。

1.2.7 蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍G250 法[14]測定發酵液中蛋白質含量。準確稱取考馬斯亮藍G250 試劑100 mg，溶于50 mL 95%乙醇，加入85%（磷酸，用水稀釋至1 000 mL備用。利用牛血清白蛋白制備標準曲線，線性方程y=0.005 5x+0.064，R2=0.999 4。試驗前取離心后的咖啡果皮酵素200 μL，加水稀釋至1 000 μL，然后加入5 mL 配制好的考馬斯亮藍G250 溶液，混勻，靜置反應10 min。以去離子水做空白對照，在595 nm 波長下測定吸光度，計算蛋白質含量。

1.2.8 DPPH 自由基清除能力的測定[15]

取5 μL 離心后的咖啡果皮酵素于10 mL 潔凈干燥的離心管中，加入去離子水補足至2 mL，再分別加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液，25 ℃恒溫水浴30 min，以去離子水調零，于517 nm 下檢測樣品吸光度。

式中：A0為去離子水為參比溶液的吸光度；A1為樣品吸光度；A2為本底管的吸光度。

1.2.9 ABTS+自由基清除能力的測定[16]

用5 mmol/L 的pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將ABTS 稀釋到7 mmol/L，加入過硫酸鉀溶液，得到最終濃度為2.45 mmol/L ABTS 溶液，在暗處室溫放置12 h～16 h。使用前，在波長734 nm 處，用PBS 緩沖液將ABTS 溶液稀釋至吸光度為0.7±0.02。

分別取4 μL 的離心后的咖啡果皮酵素于10 mL潔凈干燥的離心管中，用上述PBS 溶液補足至300 μL，再加入5 mL 上述稀釋液，30 ℃下反應1 h，734 nm 下測吸光度。

式中：A0為去離子水為參比溶液的吸光度；A1為樣品吸光度；A2為本底管的吸光度。

1.3 數據統計與分析

使用excel 2007 和Origin 86 繪制本文圖表，數據采集方法利用平均值±標準偏差（n=3）的形式表示。相關性分析采用SPSS 18.0 處理，采用Duncan 法進行多組分樣品間差異顯著性分析，其中不同字母代表差異顯著（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中總糖含量的變化

發酵過程中總糖含量變化見圖1。

在試驗過程中，加入的高濃度糖液不僅可以抑制部分雜菌生長，篩選出優勢菌群，也為微生物的生長代謝提供碳源和能源。檢測發酵過程中總糖含量的變化可以較為清晰的掌握微生物對糖類物質的利用狀態，間接地確定發酵狀態和終點。本研究以葡萄糖為標準，采用蒽酮-硫酸法繪制標準曲線，隨著葡萄糖濃度的提高，吸光度不斷增大，并呈現出良好的線性關系，線性方程為：y=0.002 1x-0.011，相關系數R2=0.999 7。發酵的前16 d，總糖含量有輕微的上升，這可能是因為發酵前期微生物繁殖較慢，對糖類物質的利用不高[17]，原料中的糖類物質溶出導致糖含量上升。發酵16 d后，總糖含量出現明顯下降，說明此時微生物開始大量利用糖類物質進行生長代謝。楊小幸等[18]對蔗糖為碳源發酵制備的蘋果酵素發酵過程中的蔗糖、果糖和葡萄糖進行檢測發現，經過20 d 的發酵，蔗糖幾乎全部轉化為葡萄糖和果糖，但總含量有明顯下降。

圖1 發酵過程中總糖含量變化Fig.1 Changes in concentration of total sugar during fermentation

2.2 發酵過程中總酸含量和pH值的變化

圖2為咖啡果皮酵素發酵過程中總酸含量變化和pH 值的變化圖。

圖2 發酵過程中總酸含量與pH值變化Fig.2 Changes in pH value，total titratable acidity during fermentation

酸度是衡量酵素成熟度的主要指標之一，pH 值是衡量發酵過程是否正常的關鍵條件。咖啡果皮中酸性物質溶出和發酵過程中產生的代謝產物都會導致咖啡果皮酵素總酸和pH 值的變化。咖啡中富含多種有機酸類物質，不同的咖啡中有機酸成分也有差異，大多咖啡中蘋果酸含量最高[19]。本研究根據GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》對咖啡果皮酵素發酵過程中的總酸含量進行滴定，以蘋果酸為基準衡量總酸含量。發酵第4 天總酸含量為0.377 mg/mL，pH 值為4.40。發酵的前20 d 總酸含量有顯著的上升，在發酵第20 天總酸含量達到7.17 mg/mL，pH 值也相應下降為4.38，這可能與部分微生物（包含醋酸菌、乳酸菌等）大量生長繁殖產生的有機酸類物質有關[20]。發酵第20 天至第32 天總酸含量有所下降，發酵32 d 過后又逐漸上升，并于第48 天達到8.17 mg/mL。總的來說，隨著發酵時間的延長，總酸含量上升，pH 值有所下降，但并不是每一個時間點兩者都呈現完全的負相關，這可能與咖啡果皮酵素中某些新生產的有機酸的緩沖性有關[21]，因此我們對發酵過程中經常會產生的有機酸[22]（包括乳酸和醋酸）的含量進行了分析。

2.3 發酵過程中乳酸和醋酸含量變化

發酵過程中乳酸和醋酸含量變化見圖3。

圖3 發酵過程中乳酸和醋酸含量變化Fig.3 Changes of lactic acid and acetic acid in the fermentation process

為確定檢測到的乳酸和醋酸是否為后期產生，本研究選擇了同批咖啡果皮原料，按照酵素制備過程中的原料與其它添加成分比，即按咖啡果皮∶水=3∶4（質量比）進行超聲輔助提取40 min，對提取液中的乳酸和醋酸進行檢測，并記為第0 天數據。如圖3，發酵前咖啡果皮中本身包含乳酸和醋酸含量分別為1.45 mg/mL和0.38 mg/mL，發酵過程中乳酸和醋酸的含量均顯著上升，乳酸含量在發酵第24 天達到最高，為2.79 mg/mL，之后趨于穩定，說明后期發酵過程中有乳酸菌的生長代謝進一步生成了乳酸。醋酸含量在發酵前16 d 上漲緩慢，在第16 天含量為0.67 mg/mL，之后含量出現顯著上升，在發酵第32 天達到2.21 mg/mL，之后逐漸趨于平穩。發酵前期酵母菌和醋酸菌菌液濃度含量較低，發酵液中富含豐富的糖類物質，醋酸菌在糖源充足的情況下直接利用葡萄糖發酵生成醋酸[23]，在酵母菌發酵生成大量乙醇后，醋酸菌將乙醇氧化成乙醛，進一步生成醋酸[24]。食醋中曲霉、酵母菌、醋酸菌具有一定的協同作用[25]，為進一步研究植物酵素中醋酸菌和酵母菌之間的關系，對咖啡果皮酵素發酵過程中的乙醇含量進行了分析。

2.4 發酵過程中乙醇含量變化

圖4是發酵過程中乙醇含量的趨勢圖。

圖4 發酵過程中乙醇含量變化Fig.4 Changes of ethanol content in the fermentation process

植物酵素天然發酵主要是利用植物表面本身所帶有的微生物進行的，酵母菌作為植物酵素發酵過程中的優勢菌群[22]，利用糖類物質代謝產生乙醇，乙醇被醋酸菌消耗生成醋酸。故對乙醇含量的檢測有助于進一步明確發酵狀態。如圖4，在發酵前16 d，乙醇含量上升尤為顯著，到發酵第16 天乙醇含量達到最高，為2.94%，發酵16 d 后乙醇含量逐漸降低，于發酵第32天降低到2.00%，并趨于平穩。管章瑞等[17]發現藍莓發酵過程中乙醇含量在發酵前6 d 不斷上升，在第6 天達到最高，為64.32 mg/mL，隨后乙醇含量逐漸降低，30 d 后乙醇含量降為23.69 mg/mL。結合發酵過程中醋酸的含量變化圖可以發現，發酵前期，酵母菌大量利用體系內的糖類物質合成乙醇，隨著乙醇濃度的上升，酵母菌大量生長繁殖。總糖濃度的下降、乙醇含量的上升抑制了酵母菌進一步的生長和代謝。乙醇逐漸被醋酸菌消耗生成醋酸，這就是發酵16 d 后醋酸含量上升伴隨乙醇含量下降的原因。

2.5 發酵過程中蛋白質含量的變化

發酵過程中可溶性蛋白質含量變化見圖5。

為研究咖啡果皮酵素發酵過程中蛋白質含量變化，本研究采用考馬斯亮藍法對咖啡果皮酵素中的可溶性蛋白質含量進行了檢測。如圖5所示，發酵前8 d，咖啡果皮酵素中蛋白質含量僅有輕微的上升，在第8天達到3.34 mg/mL，這可能與原料中本身的蛋白質溶出有關，發酵8 d 至24 d，咖啡果皮酵素中可溶性蛋白質含量有較為明顯的上升，在發酵第24 天達到最高，為0.60 mg/mL。隨后一段時間內蛋白質含量趨于平衡，發酵第40 天蛋白質含量逐漸下降，在第48 天為0.50 mg/mL。這可能是因為發酵前期，微生物生長繁殖能力不強，較高濃度的糖抑制了原料中的蛋白質溶出。隨著發酵時間的延長，發酵內環境趨于穩定，微生物開始大量繁殖，部分微生物所產生的纖維素酶和果膠酶[26-27]使咖啡果皮細胞壁破裂，蛋白質大量溶出。同時，微生物的代謝也產生了部分小分子蛋白質，導致含量上升。經過24 d 的發酵之后，體系逐漸趨于平衡，蛋白質含量也逐漸趨于穩定。經過40 d 的發酵，總糖含量下降，微生物生長繁殖速率減慢，蛋白質被部分消耗，含量有所下降。

圖5 發酵過程中可溶性蛋白質含量變化Fig.5 Changes of soluble protein in the fermentation process

2.6 發酵過程中總酚含量變化

發酵過程中總酚含量變化見圖6。

圖6 發酵過程中總酚含量變化Fig.6 Changes of total phenolic content in the fermentation process

為研究咖啡果皮酵素發酵過程中的多酚含量變化，采用福林酚法對總酚含量進行檢測。如圖6，咖啡果皮酵素在發酵前20 d 含量顯著上升，在發酵第20天達到1.71 mg/mL，后逐漸趨于平衡，前期總酚含量的上升主要是因為微生物作用導致咖啡果皮本身酚類物質的溶出有關。發酵第28 天～第32 天含量有輕微下降，之后又緩慢上升，在發酵第48 天達到1.81 mg/mL。多酚類物質具有一定的抑菌效果[28]，高濃度的多酚類物質也會抑制微生物的生長。隨著發酵時間的延長，部分微生物逐步適應高酚含量發酵環境，并逐漸將一些一大分子量的多酚被降解為小分子量酚類物質或單體酚[29]，從而使總酚含量進一步的小幅上升。

2.7 發酵過程中抗氧化能力變化

2.7.1 DPPH 自由基清除能力變化

咖啡果皮酵素發酵過程中對DPPH 自由基清除能力的變化情況如圖7所示。

圖7 發酵過程中對DPPH自由基清除能力的變化Fig.7 Changes in DPPH free radical scavenging ability during the fermentation

在整個發酵過程中咖啡果皮酵素對DPPH 自由基都具有一定的清除能力，發酵過程中前36 d 呈現緩慢上升，咖啡果皮酵素對DPPH 自由基的清除能力逐漸上升，發酵36 d 過后，清除能力進一步顯著上升。說明適當的延長發酵時間有利于提高咖啡果皮酵素對DPPH 自由基的清除能力。與發酵過程中總酚含量相比發現，隨著發酵時間的延長，總酚含量和對DPPH 自由基的清除能力都有顯著的提高，說明兩者之間具有一定的相關性。但整個發酵過程中總酚含量與DPPH自由基的清除能力并沒有呈現良好的線性關系。而是在總酚的大量積累后清除率顯著上升，這可能與原料中本身含有的酚類性質有關。

2.7.2 ABTS+自由基清除能力變化

發酵過程中咖啡果皮酵素對ABTS+自由基的清除能力如圖8所示。

整個發酵過程中，稀釋75 倍后的咖啡果皮酵素對ABTS+自由基具有良好的的清除能力，且均大于50%。隨著發酵時間的延長，對ABTS+自由基的清除能力不斷上升，在發酵第48 天時達到91.74%。說明適當的延長發酵時間有利于提高咖啡果皮酵素對ABTS+自由基的清除能力。相比咖啡果皮酵素對DPPH 自由基清除能力而言，ABTS+自由基清除能力與總酚含量的變化趨勢相似度更為明顯。Floegel A 等[30]對50 種具有富含抗氧化劑的水果的ABTS+自由基清除能力與總酚和黃酮含量做了相關性分析，發現ABTS+自由基清除能力與總酚和黃酮含量呈現顯著的相關性，這可能是本研究中ABTS+自由基清除能力與總酚含量變化趨勢較為明顯的原因。

圖8 發酵過程中對ABTS+自由基清除能力的變化Fig.8 Changes in ABTS+free radical scavenging ability during the fermentation

2.8 不同發酵時間咖啡果皮酵素聚類分析

圖9為咖啡果皮酵素發酵過程中各指標特征聚類圖。

圖9 咖啡果皮酵素不同發酵時間各指標特征聚類圖Fig.9 Characteristic clustering of different indexes in different fermentation times of coffee peel

整個發酵過程中，檢測參數較多，發酵階段難以確定，本研究采用SPSS 將發酵過程中所有檢測參數進行聚類分析，確定不同的發酵階段。聚類分析結果代表不同階段總糖、總酸、pH 值、乙醇、乳酸、醋酸、蛋白質、總酚以及抗氧化指標的總體變化規律。如圖9所示，橫坐標表示差異性，數值越大，表示不同發酵時間咖啡果皮酵素的差異越大，本研究選擇了λ=5 分類，12 個不同的發酵時間分為3 類：第一類發酵時間為4 d，第二類發酵時間為：8 d～20 d，第三類為發酵第24 天及以后。

2.9 相關性分析

為研究咖啡果皮酵素發酵過程中各種代謝產物，如總糖、總酸、pH 值、乳酸、醋酸、乙醇、蛋白質、總酚與抗氧化指標（DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力）之間的內在聯系，通過相關性分析確定各組分之間的聯系，如表1所示。

表1 發酵過程中各參數相關性Table 1 Correlation of parameters during fermentation

通過表1可以發現，總糖與pH 值與乙醇含量呈正相關，與總酸、蛋白質、乳酸、醋酸含量呈現負相關。這可能與發酵過程中微生物利用糖合成乙醇、蛋白質，代謝產生有機酸和其它酸類物質有關。乙醇與醋酸含量呈現負相關，是因為發酵16 d 后乙醇逐漸被微生物利用合成醋酸。總酚含量與ABTS+自由基清除能力和DPPH 自由基清除能力有顯著的相關性，酚類物質本身就具有良好的抗氧化功效，發酵過程中隨著總酚含量的上升，抗氧化功效顯著提高。

2.10 主成分分析

主成分分析的載荷圖如圖10所示。

圖10 主成分分析的載荷圖Fig.10 Principal component analysis of the load diagram

為進一步明確咖啡果皮酵素發酵過程中，各變量總糖、總酸、pH 值、乙醇、乳酸、醋酸、蛋白質、總酚、DPPH 自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力的相互關系，采用主成分分析（principal components analysis，PCA）對各個變量進行降維處理。抽取能夠代表大部分信息的第一主成分（貢獻率為69.352%）和第二主成分（貢獻率為19.698%），各檢測指標的位置越接近，說明這些指標之間的相關性越好。如圖10 所示，總糖、pH 值、乙醇在第一主成分和第二主成分中的系數分別為負值和正值，說明其主要貢獻為第二主成分。其它參數均位于載荷圖的右側，表示對第一主成分貢獻率較大；其中總酸、總酚、乳酸、ABTS+自由基清除能力第二主成分系數大于0，且彼此之間距離相差不大，說明這4 個檢測指標均呈現顯著的正相關，DPPH 自由基清除能力略小于0，但與總酚、ABTS+自由基清除能力距離較近。說明三者之間相關性較好；蛋白質與醋酸含量位于右下角，與總糖、pH 值、乙醇含量相反，這與前面相關性分析的結果基本一致。

12 個不同時間的咖啡果皮酵素的主成分樣品得分圖如圖11所示。

圖11 主成分樣品得分圖Fig.11 Main component sample score chart

發酵第4 天的咖啡果皮酵素位于圖像左下角，與其他時間點相比相距較遠，說明與其它發酵時間酵素性質差別較大。發酵第8 天到第20 天的咖啡果皮酵素位于圖片左上方，第一主成分系數和第二主成分系數都有了較為顯著的上升，但第一主成分系數還是為負值。發酵第24 天到第28 天第一主成分占據了絕對優勢。因此，將不同發酵時間的咖啡果皮酵素按照主成分得分分為3 個區域：N1、N2 和N3。這也與聚類分析結果一致。通過主成分分析法構建不同發酵時間樣品的綜合評價指標（comprehensive evaluation index，CEI）。以每個主成分所對應的特征值占所提取主成分的特征值之和的比例，進行線性加權求和得到CEI（如公式1）。

不同發酵時間的咖啡果皮酵素綜合指標如圖12所示。

圖12 咖啡果皮酵素綜合評價指標Fig.12 Comprehensive evaluation index of coffee peel jiaosu

發酵第4 天CEI 值最低，為-1.995，隨后CEI 值有所提高，并在第24 天時達到0.323，隨后輕微的下降之后繼續上升，在發酵第48 天達到最高，為1.027。說明適當的延長發酵時間有利于提高咖啡果皮酵素綜合指標。

3 結論

本試驗以咖啡制作過程中廢棄的咖啡果皮為原料，利用咖啡果皮表面的微生物，在高濃度糖液濃度下制備咖啡果皮酵素。對發酵過程中總糖、總酸、乳酸、醋酸、乙醇、總酚含量、pH 值及抗氧化指標（DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力）進行了檢測和分析。結果表明：發酵過程可以分為0～4 d、8 d～20 d、24 d～48 d 3 個不同時間段。微生物在發酵前期生長繁殖較慢，咖啡果皮在高糖濃度下活性物質和水分溶出，隨著發酵時間的延長，微生物大量生長產生乙醇、醋酸、乳酸和酶等代謝產物，乙醇在后期被醋酸菌代謝導致含量下降。隨著發酵時間的延長，蛋白質含量上升，咖啡果皮物質進一步溶出，總酚含量顯著上升，兩個抗氧化指標也隨之出現顯著上升。發酵過程中不同檢測指標之間具有一定的相關性，通過主成分分析發現隨著發酵時間的延長，綜合指標顯著提高，說明適當的延長發酵時間有利于提高咖啡果皮酵素成熟度和抗氧化功效。