沙棘甾醇化合物的分離純化研究

龔晨，高慶超，常應九，王悅，王樹林，2，*

（1.青海大學農牧學院，青海西寧810016；2.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海西寧810016）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）為胡頹子科沙棘屬，包括柳葉沙棘、中國沙棘、中亞沙棘等。主要分布于我國青海、新疆等，種植面積占全世界的90%[1]。沙棘具有多種生物活性成分，如維生素C、黃酮、植物甾醇等。其中植物甾醇主要有β-谷甾醇、豆甾醇等，具有乳化性和穩定性，并能明顯地降低體內膽固醇水平[2]，對腫瘤的生長和癌細胞的擴散具有一定的抑制效果[3]。此外，還可促進機體對免疫系統的調節，并具有較強的抗氧化作用，已運用于醫藥、化妝品、食品、光學產品、植物基因工程等相關領域[4]。

目前國內外對植物甾醇提取分離的方法有皂化法、酯化法、溶劑結晶法、酶法和沸石吸附法等[5-6]。其中，最常用的方法是溶劑結晶法。該法可制備出高純度的產品，且具有簡便的工藝流程，適合工業化的連續生產。確定規?；a前的工藝數據，是β-谷甾醇生產工藝研究的關鍵內容[7]。植物甾醇的純化主要采用大孔樹脂吸附法、分子蒸餾法、超臨界CO2萃取法等[8-9]。由于大孔吸附樹脂有較高的穩定性、較好的吸附選擇性、較溫和的解吸條件、較長的使用周期等特點，因而具有較好的純化效果。植物甾醇的鑒定方法主要有反式高效液相色譜法、紅外光譜法、薄層色譜法和氣相色譜法等[10]。其中，薄層色譜法快捷簡便、成本低，適合用作混合物中主要成分的快速分離與鑒定。

本試驗采用皂化法通過單因素和正交試驗確定制備β-谷甾醇粗制品的最佳工藝參數；利用重結晶法和大孔吸附樹脂法對甾醇粗制品進行精制和純化，并用薄層色譜法進行鑒定，以便提高β-谷甾醇的純度。該研究結果可為今后沙棘中生物活性成分（β-谷甾醇）的理論研究、產品開發及工業化生產提供一定的理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AL204 萬分之一分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHSJ-4A 型pH 計：上海儀電分析儀器有限公司。

沙棘籽油：青海清華博眾生物技術有限公司；β-谷甾醇標準品（98%）：合肥博美生物科技有限責任公司；AB-8 大孔樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司；無水乙醇（AR）：天津市富宇精細化工有限公司；三氯化鐵（AR）：昌邑宏達化工有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 β-谷甾醇標準曲線的繪制

將20 mg β-谷甾醇標準品溶于10 mL 無水乙醇中，配制成2 mg/mL β-谷甾醇標準溶液。使用時稀釋10 倍，分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 的200 μg/mL β-谷甾醇標準溶液于試管中，均以無水乙醇定容至4 mL，加入硫磷鐵顯色劑2 mL，振蕩搖勻，室溫下靜置15 min 后進行全波長掃描，并在最大吸收波長處測定吸光值。以β-谷甾醇溶液質量濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 β-谷甾醇含量的的測定

將供試甾醇樣品配制成濃度為0.04 mg/mL 的溶液。按照1.2.1 中的操作方法，于最大吸收波長處測定其吸光值，并計算β-谷甾醇含量[11]，公式如下：

β-谷甾醇百分含量/%=（W×V×T）/M×100

式中：W為吸光值對應的樣品中β-谷甾醇的濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；T為稀釋倍數；M為樣品質量，mg。

1.2.3 β-谷甾醇的鑒定

參照文獻并稍作修改[12-14]，采用薄層色譜法進行鑒定。以石油醚∶乙醚=8∶2（體積比）的混合液為展開劑，10%的硫酸-無水乙醇溶液為顯色劑，計算比移值，以鑒定混合物中的甾醇種類。

參照公式：Rf=A/B

式中：A為原點至斑點的距離，cm；B為原點至溶劑前沿的距離，cm。

1.2.4 沙棘甾醇分離純化工藝

沙棘籽油→皂化→旋轉蒸發濃縮→乙酸乙酯萃取→水洗至中性→旋轉蒸發濃縮→干燥→甾醇粗制品→重結晶→甾醇精制品→大孔樹脂吸附→薄層色譜鑒定

準確稱取2.0 g 沙棘籽油于100 mL 具塞三角瓶中，按照比例加入50%KOH-無水乙醇混合液，置于恒溫振蕩器中皂化，震蕩結束后，立即將皂化液放入冰水浴中冷卻。加入90 mL 蒸餾水，用30 mL 乙酸乙酯萃取3 次，合并上清液，再用蒸餾水洗滌至中性。用旋轉蒸發儀蒸發至體積約30 mL 后，烘干稱重，即為甾醇粗制品，并計算其得率（得率/%=甾醇粗制品質量/原料油質量×100）。

取一定量甾醇粗制品，加熱溶于適當體積的無水乙醇，置于4 ℃冰箱內養晶一段時間后，減壓抽濾，收集濾紙上的晶體，并用旋轉蒸發儀除去母液中的部分乙醇后，再次將其放置冰箱中繼續養晶，一定時間后再次抽濾；重復3 次上述步驟。收集不同結晶時間得到的晶體，即為甾醇精制品，測定其中β-谷甾醇的含量。

利用大孔樹脂吸附法，將吸附液上樣并靜置數小時后，加入解吸液進行洗脫，收集具有相同時間間隔的流出液，并將其烘干稱重，測定其中β-谷甾醇的含量。并將純化前后的β-谷甾醇分別進行薄層色譜鑒定。

1.2.4.1 β-谷甾醇粗制品制備的單因素試驗

參考相關文獻及預試驗結果[15]，考察50%KOH-無水乙醇溶劑配比為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15（體積比）；料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）；皂化時間為1、2、3、4 h；皂化溫度為70、80、90、95 ℃對 β-谷甾醇粗制品得率的影響。

1.2.4.2 β-谷甾醇粗制品制備的正交試驗

參考文獻[15]及單因素試驗結果，正交試驗考察的因素為溶劑配比、料液比、皂化溫度、皂化時間，指標為甾醇粗制品得率，按照正交表L9（34）設計四因素三水平正交試驗，正交試驗因素水表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal experiment

1.2.4.3 重結晶次數對β-谷甾醇純度的影響試驗

稱重干燥后的甾醇粗制品，按料液比為1∶15（g/mL）的比例加入無水乙醇加熱至溶解，放置于冰箱4 ℃下養晶24 h，減壓抽濾后，收集濾紙上的晶體，并用旋蒸儀使濾出母液的體積濃縮至原體積的1/2 并放置在4 ℃的冰箱中，養晶24 h 后再次減壓抽濾；重復上述步驟3 次。將收集的晶體干燥保存，分別測定其中β-谷甾醇的含量。

1.2.4.4 β-谷甾醇的純化及鑒定

采用大孔吸附樹脂法，參考文獻并作修改[16]。本試驗選用AB-8 大孔吸附樹脂，將晶體配制成0.10 mg/mL的吸附液；解吸液按照95%乙醇∶三氯甲烷=1∶5（體積比）進行配制。將吸附液上樣4 h 后，加入解吸液進行洗脫，每隔15 min 分別對流出液進行收集，將收集液放置于60 ℃的烘箱中使溶劑全部蒸發后稱重，再用無水乙醇配制成0.1 mg/mL 的待測液，測定其吸光值，計算β-谷甾醇的含量。

將純化前后的β-谷甾醇分別利用薄層色譜法對混合物中甾醇的種類進行定性分析。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS2.0 軟件和Excel 軟件進行數據處理與分析。

2 試驗結果與分析

2.1 β-谷甾醇的標準曲線

對β-谷甾醇標準溶液進行全波長掃描，確定其最大波長為442 nm（如圖1所示）。以β-谷甾醇標準溶液質量濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.229x+0.032（R2=0.998 8），其中y 為吸光值A；x 為β-谷甾醇標準溶液質量濃度（如圖2）。

圖1 β-谷甾醇標準品的全波長掃描圖Fig.1 Scanning diagram of full wavelength of β-sitosterol sample

圖2 β-谷甾醇標準曲線Fig.2 The standard curve of β-sitosterol

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 溶劑配比對甾醇粗制品得率的影響

溶劑配比對甾醇粗制品得率的影響見圖3。

圖3 溶劑配比對甾醇粗制品得率的影響Fig.3 Effects of solvent ratio on the yield of sterol crude products

由圖3可以看出，溶劑50%KOH-無水乙醇配比為1∶10（體積比）時，甾醇粗制品得率達到最大，隨溶劑配比進一步增大，得率有小幅度下降。原因是當溶劑配比較低時，皂化不夠充分，導致得率較低；溶劑配比過高時，增加了水洗難度[10]。所以溶劑配比1∶10（體積比）為最佳。

2.2.2 料液比對甾醇粗制品得率的影響

料液比對甾醇粗制品得率的影響見圖4。

圖4 料液比對甾醇粗制品得率的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on the yield of sterol crude products

由圖4可知，當料液比1∶15（g/mL）時，甾醇粗制品得率最高。這是由于料液比較低時，提取不夠充分，導致得率較低；料液比較高時，水洗過程中KOH 與甾醇分離不完全，同時也增加了試劑用量的需求和后期濃縮的難度[10]。所以料液比1∶15（g/mL）最為合適。

2.2.3 皂化時間對甾醇粗制品得率的影響

皂化時間對甾醇粗制品得率的影響見圖5。

圖5 皂化時間對甾醇粗制品得率的影響Fig.5 Effects of saponification time on the yield of sterol crude products

由圖5可知，隨皂化時間的延長，甾醇粗制品得率呈現先增后降的趨勢。最佳皂化時間確定為2 h。皂化時間過短，導致皂化不完全。皂化時間過長，不易萃取分離，且會增加生產成本，降低生產效率。因此，最佳皂化時間為2 h。

2.2.4 皂化溫度對甾醇粗制品得率的影響

皂化溫度對甾醇粗制品得率的影響見圖6。

由圖6可知，甾醇粗制品得率由于皂化溫度不同，呈現一定幅度的變化，且最適皂化溫度為90 ℃。隨皂化溫度上升，得率下降，原因是溫度升高可加速溶質的擴散和溶劑的滲透，使β-谷甾醇不斷溶出；但溫度過高會加快雜質的溶出，影響β-谷甾醇粗制品得率。所以最佳皂化溫度為90 ℃。

圖6 皂化溫度對甾醇粗制品得率的影響Fig.6 Effects of saponification temperature on the yield of sterol crude products

2.3 正交試驗結果與分析

以溶劑配比、液料比、皂化溫度、皂化時間為考察因素，以甾醇粗制品得率為評價指標，采用L9（34）設計四因素三水平正交試驗，優化甾醇粗制品提取工藝，試驗結果見表2。

表2 正交試驗方案及結果Table 2 Results and scheme of orthogonal experiment

根據表2，由極差分析可知，對β-谷甾醇粗制品得率產生影響的的主次因素：溶劑配比＞料液比＞皂化溫度＞皂化時間。優選組合為A3B3C2D1，即溶劑配比1∶12.5（體積比）、料液比1∶17.5（g/mL）、皂化溫度90 ℃、皂化時間1.5 h。在此條件下甾醇粗制品的得率為（2.41±0.18）%。在驗證試驗中，按照最佳工藝條件制得的晶體中，β-谷甾醇的含量達到（91.41±0.21）%。

2.4 重結晶次數對β-谷甾醇純度的影響結果

重結晶次數對β-谷甾醇純度的影響結果見圖7。

由圖7可知，樣品中β-谷甾醇純度隨重結晶次數增加而下降，第一次結晶得到的晶體中，β-谷甾醇含量為（91.41±0.75）%；第二次得到的晶體中，β-谷甾醇的含量為（72.81±0.12）%，第三次得到的晶體中，β-谷甾醇的含量為（56.03±1.39）%。

圖7 重結晶次數對β-谷甾醇純度的影響Fig.7 Influence of recrystallization number on the purity of βsitosterol

2.5 大孔吸附樹脂純化結果

洗脫時間對β-谷甾醇純度影響的結果見圖8

圖8 洗脫時間對β-谷甾醇純度的影響Fig.8 Influence of elution time on the purity of β-sitosterol

由圖8可知，用解吸液進行洗脫時，隨時間的延長，β-谷甾醇的純度呈現先上升后下降的走勢。在46 min～60 min 的時間段內，收集液中β-谷甾醇含量的含量最高，干制后產品中β-谷甾醇含量為（93.54±0.18）%；在46 min～90 min 內，β-谷甾醇百分含量均在92%以上，達到了一定的純化效果。

2.6 薄層色譜鑒定結果與分析

對純化后的沙棘β-谷甾醇的采用薄層色譜進行鑒定，鑒定結果見圖9。

圖9 薄層色譜鑒定圖Fig.9 Chart of TLC identification

由圖9可知，純化前后的樣品中都只有一種組分，且該組分與β-谷甾醇標準品有相同的比移值（Rf=0.29±0.01），因此，可以推斷該混合物的組分為β-谷甾醇。

3 討論

在試驗中，采用皂化法提取沙棘籽油中甾醇化合物，通過單因素試驗與正交優化設計確定了提取最佳工藝條件為：溶劑50%KOH-無水乙醇配比1∶12.5（體積比）、料液比1∶17.5（g/mL）、皂化溫度90 ℃、皂化時間1.5 h。在此條件下甾醇粗制品得率為2.41%。這為今后沙棘籽油中甾醇成分的研究提供參考。由于皂化法的弊端，使得沙棘籽油在經過皂化完成后無法再次利用，因此，優化或開發新的甾醇提取分離方法將是今后的一個研究重點與難點。

由圖7可知，重結晶過程中，β-谷甾醇純度可達（91.41±0.75）%，這是由于溫度降低時，β-谷甾醇的溶解度急劇下降，而其他種類甾醇的溶解度變化不明顯[17]，從而達到精制效果。許文林等[18]研究發現在結晶時間20 h 時，β-谷甾醇純度最高，與本試驗結果基本吻合。

由圖8可知，隨著洗脫時間的延長，β-谷甾醇純度先上升后下降。原因是在開始洗脫時，由于β-谷甾醇未完全溶解到解吸液中，導致初始階段的收集液中β-谷甾醇濃度偏低[19]；在46 min～90 min 時，β-谷甾醇純度達到92%以上。這將為今后沙棘功能活性成分（β-谷甾醇）高附加值產品的研發提供理論依據。

4 結論

皂化法制備甾醇粗制品的最佳工藝條件為：料液比1∶17.5（g/mL）、溶劑50 % KOH：無水乙醇配比1∶12.5（體積比）、皂化時間1.5 h、皂化溫度90 ℃，得率為2.41%。通過重結晶法精制，β-谷甾醇純度可達91.41 %。利用大孔吸附樹脂法純化時，洗脫時間在46 min～60 min 內，β-谷甾醇純度達到93.54%，經薄層色譜法鑒定，純化后的沙棘甾醇為β-谷甾醇。