響應面優化超聲輔助提取胭脂果色素工藝研究

張言，高定烽，李思敏，熊華斌，2，3，*，高云濤，楊志

（1.云南民族大學化學與環境學院，云南昆明650500；2.云南省跨境民族地區生物質資源清潔利用國際聯合研究中心，云南昆明650500；3.民族地區礦產資源綜合利用重點實驗室，云南昆明650500）

胭脂果又名鬼眼睛果、狗眼睛果等。胭脂果樹木分布并不是非常廣泛，主要生長在云南省的德宏州，8月生長最為茂盛，富含黃酮類、內酯、蛋白質、脂肪和微量礦物質，是補氣血的佳果。此外含有大量胡蘿卜素、黃酮和維生素C，可以增加人體的免疫力，滋潤皮膚，具有延緩衰老、抗癌等作用。采摘后的新鮮水果，可以直接食用，也可以用鹽和辣椒腌制，或者用白糖燉煮。它具有強化脾臟開胃的作用，對消化不良有很大幫助。

近幾年國內對植物天然色素的提取[1-3]有很大的進展研究，但對胭脂果的研究鮮有報道，為了更好的、更科學的開發利用胭脂果資源，本試驗以胭脂果為原材料，采用超聲輔助提取胭脂果色素，通過單因素[4-5]和響應面試驗[6-7]進行優化得到最佳提取條件，實現工業化生產，旨在為胭脂果色素的綜合開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胭脂果果實采自于德宏盈江；95%乙醇、乙酸乙酯、乙二醇、石油醚（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

SJIA-2012 超聲波細胞破碎機、DC-2006 低溫恒溫槽：寧波雙嘉儀器有限公司；8453 型紫外可見分光光度計：美國安捷倫公司；FA2004 電子分析天平：上海上平儀器公司；HH-6 雙列六孔水浴鍋：力辰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色素最佳溶劑的選擇及最大吸收峰的測定

稱取2.0 g 胭脂果干燥果實7 份，放置于7 個50 mL燒杯內，分別加入50 mL 超純水、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、乙二醇，然后在室溫下振蕩萃取12 h，過濾，濾液做光譜掃描測定。

取2.0g 胭脂果干燥果實樣本，按液固比10∶1（mL/g）加入上述最佳的提取溶劑，分置于50、60、70 ℃水浴中萃取2 h，以4 000 r/min 離心10 min，取上清液，備測。備測樣品用對應溶劑稀釋25 倍，再進行200 nm～700 nm 的光譜掃描，得到色素溶液的吸收光譜和最大吸收峰。

1.3.2 考察提取液固比

準確稱取2.0 g 胭脂果干粉共6 份，分別置于6 個200 mL 燒杯中，以保鮮膜封口，按液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）加入最佳的溶劑開展平行色素提取試驗，每個平行組均置60 ℃水浴中浸提2 h，然后取濾液離心，稀釋相同的倍數，備測。

1.3.3 考察超聲功率

精確稱取2.0 g 胭脂果胭脂果干粉共7 份，置于200 mL 燒杯中，以保鮮膜封口并置60 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各燒杯，設置液固比為15∶1（mL/g），超聲時間為40 min，分別以100、200、300、400、500、600、700 W 進行超聲輔助提取，然后取濾液離心，稀釋相同的倍數，備測。

1.3.4 考察超聲時間

準確稱取7 份2.0 g 胭脂果干粉，置于200 mL 燒杯中，將瓶口以保鮮膜封口并置60 ℃水浴中浸提2 h，然后取出各燒杯，設置液固比為15∶1（mL/g），超聲功率為500W，分別超聲輔助提取10、20、30、40、50、60min，然后取濾液離心，稀釋相同的倍數，備測。

1.3.5 色素超聲輔助提取的響應面法優化

選取色素提取試驗中的液固比、超聲功率和超聲時間3 個因素為自變量，以提取色素的吸光度值為響應值，采用Design Expert 軟件進行試驗設計[8]，然后根據所得設計結果進行試驗，最終采用所得試驗結果進行響應面分析，獲取所需試驗數據。

2 結果與分析

2.1 色素最佳溶劑的選擇及最大吸收峰的測定

不同種類溶劑對胭脂果果實色素的溶解性見表1。

表1 不同種類溶劑對胭脂果果實色素的溶解性Table 1 Solubility of different kinds of solvent to pigment of carmine fruit

由表1可知，在胭脂果色素振蕩萃取的試驗中，對比7 種溶劑，50%乙醇是色素溶出的最佳的溶劑，故均用50%乙醇作為溶劑進行以下試驗。

50、60 ℃和70 ℃水浴萃取的上層清液在200 nm～700 nm 范圍光譜吸收圖見圖1。

如圖1所示三者都有相似的光譜圖，都顯示277 nm是色素溶液的最大光吸收波長。并在277 nm 波長處的吸光度分別是：0.614、0.831 和0.824。說明60 ℃是50%乙醇萃取胭脂果色素的最佳溫度，50 ℃時吸光度是最低的，70 ℃時吸光度略低于60 ℃，但是由于乙醇的沸點為78.15℃，所以在70 ℃下已經接近揮發，損耗太大[9]，所以為了后續試驗故使用60 ℃作為提取溫度。

圖1 胭脂果果實色素溶液的吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of pigment solution of carmine fruit

2.2 液固比對色素提取的影響

不同液固比條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度見圖2。

圖2 不同液固比條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度Fig.2 Absorbance of carmine fruit pigment solution extracted under different liquid ratios

由圖2可知，在液固比5∶1（mL/g）～30∶1（mL/g），提取率隨液固比增大呈上升趨勢，液固比增加到15∶1（mL/g）時，色素提取的吸光度達到最大，液固比大于15∶1（mL/g）時，色素提取的吸光度隨著液固比增加而緩慢減少，這是由于隨著胭脂果干粉質量增加，溶解的色素也在增加，但是乙醇體積有限，溶解能力有限，無法將胭脂果干粉全部溶解，故色素提取的吸光度值反而降低，因此出現提取吸光度隨著液固比增加，而提取率下降的現象。所以本試驗選擇了液固比為15∶1（mL/g）。

2.3 超聲功率對色素提取的影響

不同超聲功率條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度見圖3。

圖3 不同超聲功率條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度Fig.3 Absorbance of carmine fruit pigment solution extracted under different ultrasonic power

由圖3可知，超聲輸出100 W 到200 W 時吸光度幾乎沒有變化。但從200 W 開始，隨著輸出功率的增加，色素的吸光度也開始開始增加，至超聲功率為500 W 時，色素的吸光度值達到了最大為0.874；繼續增大超聲功率，提取果實色素的溶液吸光度反而下降。對胭脂果果實色素提取的這種影響，可能是由于超聲功率過高，超聲波對胭脂果的組織結構產生了破壞作用[10-11]，體系中有微小的淀粉顆粒析出并吸附了部分色素分子，這一部分色素在離心過程中被沉淀，從而造成提取液的吸光度降低[12]。所以本試驗選擇了超聲功率為500 W。

2.4 超聲時間對色素提取的影響

不同超聲時間條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度見圖4。

圖4 不同超聲時間條件下提取的胭脂果色素溶液的吸光度Fig.4 Absorbance of carmine fruit pigment solution extracted under different ultrasonic time conditions

由圖4可以看出，在0 min～20 min 時，隨著超聲時間的延長，提取液的吸光度值呈直線上升趨勢；與0min～20 min 時相比，隨著超聲時間的延長，20 min～50 min時提取液的吸光度值較平緩，這可能是由于隨著超聲時間的延長，溶劑體系的滲透壓接近平衡，色素隨著溶劑向細胞外緩慢擴散[13]，從而表現為提取液的吸光度增加緩慢。所以本試驗選擇了超聲時間為60 min。

2.5 色素超聲輔助提取的響應面法優化

2.5.1 中心復合實驗設計（central composite design，CCD）設計及其試驗結果

在超聲輔助提取胭脂果色素工藝的過程中，單因素試驗可以考察不同條件對胭脂果素色提取的影響，而響應面分析法則可以同時考察多因素相互作用下胭脂果素色的提取效果，更直觀的反應各因素的影響情況和程度[14]。在探究胭脂果素色提取的過程中，適當超聲的引入有利于提高胭脂果色素的提取率，但大功率的超聲的使用則產生反作用，由此可見，超聲功率是構建胭脂果色素的提取的關鍵性因素，故選取超聲功率作為響應面分析的影響因素。此外，在單因素試驗中，一定范圍內的液固比和超聲時間對胭脂果素色的提取的影響較為顯著，故將其作為響應面分析的影響因素。因此，采用Design-Expert 8.05 軟件[15]中的中心復合實驗設計（central composite design，CCD）法對色素提取體系中液固比、超聲時間和超聲功率對色素提取的影響進行探究。根據CCD 設計原理，液固比、超聲時間和超聲功率各設置3 個水平，因素水平表見表2。

表2 響應面優化超聲輔助提取試驗的因素與水平值Table 2 Factors and levels of response surface optimization for ultrasonic assisted extraction test

通過Design-Expert 8.05 分析軟件獲得的試驗方案及其采用該方案獲得的試驗結果如表3所示。

表3 CCD試驗設計及試驗結果Table 3 CCD test design and experimental results

續表3 CCD試驗設計及試驗結果Continue table 3 CCD test design and experimental results

2.5.2 回歸和方差分析

以胭脂果色素的提取為響應值，在響應面分析軟件中對液固比、超聲時間和超聲功率進行回歸擬合，響應值R（吸光度）與各影響因子間的回歸方程為：

R=0.81+0.14A+0.020B+0.052C-6.000×10-3AB+0.010AC+0.036BC-0.027A2-0.045B2-0.054C2所得模擬方程具有較好的相關性，相關系數為R2=0.988 4。此外，對回歸模型進行了方差分析，結果如表4所示。

表4 色素提取回歸方差分析結果Table 4 Regression variance analysis results of pigment extraction

建立模型的P＜0.000 1，具有高度顯著性，失擬項的P＞0.1，無顯著性，由此可見，所建模型可用于色素提取的響應面分析。此外，A、B、C、A2、B2、C2項的P值均小于0.05，表現出顯著性，這表明液固比、超聲時間和超聲功率均為提取過程中影響色素提取的主要因素，其中，A、A2、C2項的P＜0.000 1，即液固比對色素提取的影響高度顯著。AB、AC、BC項中，僅有AC的P＜0.05，這表明液固比和超聲功率對色素提取的影響在一定程度上表現出交互作用，而其他因素間則無此效應。

2.5.3 響應面分析

各因素及其交互作用對超聲輔助提取影響的響應面圖見5。

圖5顯示了液固比（A）、液固比超聲時間（B）和超聲功率（C）3 個因素對胭脂果色素提取的等高線圖（a、c、e）和3D 響應面圖（b、d、f）。由圖5a 可以看出，沿著B因素（超聲時間）向峰值方向移動，其等高線的密度明顯低于沿A因素（液固比）方向，由此可見，相對于超聲時間，液固比對胭脂果色素提取的影響更為顯著。由對應的3D 響應面圖（5b）也能獲取相同的結果，在B因素方向，響應面曲線較為平緩，說明超聲功率對色素提取的影響較小，隨超聲時間的增加，色素提取有增加的趨勢，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著，而沿A因素方向則出現了較為明顯的變化，響應面曲線較陡，液固比引起色素提取的變化較大，說明液固比色素提取的影響大于超聲時間。

圖5c和圖5d則顯示了A 因素（液固比）和C 因素（超聲功率）對色素提取的影響。由等高線圖可以看出，沿著C 因素（超聲功率）向峰值方向移動的等高線密度也要相對低于沿A 因素（液固比）方向。由3D 響應面圖則可以看出，在A 因素方向響應面曲線有一定的坡度，但是，在C 因素方向，響應面曲線較為平緩，說明超聲功率對色素提取的影響較小，隨超聲功率的增加，色素提取有增加的趨勢，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著。由此可見，A 因素變化對結果的影響要高于C 因素，即相對于超聲功率，液固比的影響更大。

圖5 各因素及其交互作用對超聲輔助提取影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of each factor and its interaction effect on ultrasonic assisted extraction

由圖5e和圖5f可以比較B 因素（超聲時間）和C因素（超聲功率）對色素提取的影響。由兩因素沿峰值方向的等高線密度及其3D 響應面圖中響應面曲線的陡峭程度可以看出，B、C 兩因素的影響也存在較大差異，相對于超聲功率，超聲時間的影響較弱一些。響應面分析直觀反映了各因素的影響情況，其效果優于單因素試驗，綜合分析可以發現，3 個因素對色素提取的影響有所不同，其程度大小為：液固比＞超聲功率＞超聲時間。

通過響應面分析模型對色素提取條件進行了優化分析，預測的最優條件為：液固比16.82∶1（mL/g）、超聲時間45.96 min、超聲功率475.85 W，預測的最優色素提取吸光度值為0.959。為了提取色素試驗的可控性和可行性，對預測條件進行了修正：液固比17∶1（mL/g）、超聲時間46 min、超聲功率480 W。通過試驗檢驗最優預測條件下的提取效果，色素提取吸光度值與預測值相接近，達到0.94，相差0.019。

3 結論

以胭脂果為研究對象，采用超聲輔助手段對胭脂果的色素進行提取。通過單因素試驗可知液固比、超聲功率和超聲時間對色素提取均有顯著影響作用。通過響應面分析模型對色素提取條件進行了優化分析，預測的最優條件為0.959。通過試驗檢驗最優預測條件下的提取效果，色素提取吸光度值與預測值相接近，達到0.94，相差0.019。