交叉引物擴增法檢測食品中大腸桿菌不耐熱腸毒素的研究

劉文鑫，袁超文，張力國，馮瑜菲

（1.湛江中心人民醫院，廣東湛江524045；2.東北大學生命科學與健康學院，遼寧沈陽110169；3.遼寧省重大動物疫情應急中心，遼寧沈陽110161；4.廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江524001）

隨著我國食品工業的快速發展，由食源性致病菌引起的食物中毒和食源性疾病爆發頻率呈上升趨勢，不僅危害人類的健康和生命，也對公共衛生事業和國家經濟造成嚴重損失[1]。我國衛生部提供統計資料顯示，2015年共爆發地區性食源性疾病總數為169 起，患病5 926 人，死亡121 人，其中微生物性食物中毒人數最多，占全年食物中毒總人數的53.7%。食源性病原微生物可通過食物鏈的任何一個環節隨著污染的食物和水進入機體，現已確認有超過30 多種病原菌可以引發食源性疾病，常見的食源性致病菌包括腸出血性大腸桿菌 （enterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC）、沙門氏菌（Salmonella spp）、產腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等[2]。ETEC 被視為引起人類腹瀉的主要病原之一，在全球范圍內，每年可導致數億人發生腹瀉，尤其是發展中國家的嬰幼兒和兒童。同時也是引起旅行者腹瀉的主要原因[3]。ETEC 產生的細菌定植因子（clonization factor，CF）和腸毒素是關鍵的毒力因子，首先CF 特異性黏附到小腸粘膜上皮細胞表面的受體，隨后菌體大量合成并分泌耐熱腸毒素（heat-stable enterotoxin，ST）或不耐熱腸毒素（heat-labile enterotoxin，LT）刺激腸上皮細胞產生大量環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），致使細胞內液體及電解質流失引起人或動物發生嚴重腹瀉[4-5]。隨著我國食源性疾病爆發率不斷上升，在食品污染所引發的腸道疾病中，LT 仍是不可忽略的重要因素之一[6]，因此，快速、靈敏地檢測食品中的LT 毒力基因已成為控制食品安全問題的關鍵。

目前對于不耐熱腸毒素毒力基因的檢測方法歸納起來可分為傳統培養檢測技術和分子檢測技術，傳統培養檢測技術操作較為耗時、繁瑣、檢測靈敏度也較低，在應對突發性食品安全公共事件上，不能滿足快速、準確、高靈敏和特異性等要求[7]。分子檢測技術主要包括聚合酶鏈反應技術（polymerase chain reaction，PCR）、DNA 探針技術、生物芯片技術和等溫擴增技術等，這些技術具有快速，特異，敏感和節約時間以及勞動成本的特點而被廣泛使用。交叉引物等溫擴增（cross priming amplification，CPA）技術是近年來被廣泛應用的一種新型等溫擴增技術，利用5 條特異性引物和具有鏈置換活性的Bst-DNA 聚合酶在等溫條件下對靶基因不斷地進行循環擴增[8]。與傳統的PCR 方法相比，CPA 技術不僅擺脫了對昂貴儀器設備的依賴，降低檢測成本，同時因具有較高的特異性和敏感性，極大程度地提高了檢測效率，縮短檢測時間[9]。該方法被視為繼環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）之后的又一項被廣泛用于科學研究、疾病診斷和食品微生物檢測等領域的新型核酸等溫擴增技術[10]。

本研究以LT 保守序列作為靶基因設計CPA 特異性引物，并與LAMP 和熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法進行對比，以期為不耐熱腸毒素基因的診斷提供一種快速、靈敏、肉眼即可判斷的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑與樣本

Trans 2k plus II DNA Marker、脫氧核糖核苷三磷酸 （deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）、MgCl2、DNA 提取試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；甜菜堿：Sigma 上海貿易有限公司；瓊脂糖：北京沃比森科技有限公司；SYBR Green I 染料：北京索萊寶科技有限公司；Bst-DNA 聚合酶大片段：NEB（北京）有限公司；華峰管：廣州華峰生物科技有限公司；本研究所用引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

46 份生豬肉樣品購自當地市場，經鑒定均不含不耐熱腸毒素大腸桿菌。

1.1.2 菌種來源

大腸桿菌參考菌株C83903（LT+）、C83920（Sta+）、C44498（Stx2e+）和O157：H7：中國獸醫藥品監察所；大腸桿菌ATCC 43886（LT+）、產氣莢膜梭菌ATCC 13124、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、腸炎沙門氏菌ATCC 13076、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC 23715、副溶血性弧菌ATCC 27519、大腸桿菌OS-13（Stb+）均為東北大學生命科學與健康學院保存。

1.2 儀器與設備

電泳儀（DYY-2）、電泳槽（DCY-31D）：北京六一儀器廠；生化培養箱（SPX-150B-Z）：上海博迅實業公司；凝膠成像系統（Tanon 2500R）：上海天能科技有限公司；臺式高速離心機（TG16.5）：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（歐萊博H-W420）：山東博科科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成

以不耐熱腸毒素家族A 亞基保守序列（GenBank登錄號為JX504011.1）為靶基因，應用在線軟件Primer-Explorer V4 設計CPA 特異性引物，Real-time PCR 和LAMP 引物序列見表1。

表1 CPA、LAMP和熒光定量PCR擴增引物Table 1 Primers of CPA，LAMP and qPCR assays

1.3.2 模板的制備

將C83903（LT+）菌株接種于麥康凱瓊脂平板37 ℃倒置培養16 h～24 h。然后挑取單個菌落接種于LB 液體培養基中，37 ℃200 r/min 過夜振蕩培養。取5 mL 培養物，經10 000 r/min 離心3 min，取上清液作為DNA模板，-20 ℃備用。

1.3.3 生豬肉人工隨機污染

將C83903（LT+）菌株接種于新鮮無菌的麥康凱培養基中于37 ℃過夜培養后進行1 000 倍稀釋，隨后將稀釋后的菌液隨機污染不含LT 毒素的生豬肉樣品勻漿液中。10 000 r/min 離心3 min，棄去上清液，用1 mL 0.9%生理鹽水懸浮菌體，作為產腸毒素大腸埃希氏菌人工污染樣本，并做好記錄。

1.3.3 反應條件優化

首先對CPA 的特異性引物進行驗證，25 μL 反應體系中含有2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、10×Thermopol Buffer 2.5μL、0.8 mol/L Betaine 2 μL 、8 U/管Bst-DNA 聚合酶大片段，1s 5 μL，2a/3a各2 μL，4s/5a 各1 μL，以上引物濃度均為10 μmol/L，并在60 ℃恒溫條件下作用60 min。反應結束后于80 ℃條件下加熱5 min 以終止反應。隨后將華峰管內反應產物與預先加入的1 μL（2 000×）SYBR Green I 染料混勻后分別于自然光和紫外下觀察，并用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳對產物進行分析。

為確定CPA 最佳的反應溫度、dNTPs 濃度、Bst 聚合酶濃度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度和反應時間，每個反應均重復3 次，反應體系構成與步驟同上。分別改變反應溫度（60、62、64、66、68、70 ℃）、dNTPs 濃度（0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L）、Bst 酶濃度 （6、8、10、12 U/管）、Mg2+濃度（1.0、2.0、3.0 mmol/L）、甜菜堿濃度（0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L）以及反應時間（15、30、45、60、75、90 min），反應產結束后熱終止反應，并用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.4 特異性檢測

本研究共使用14 株試驗菌（6 株大腸桿菌和8 株非大腸桿菌）對CPA 進行特異性檢測，同時設定不添加模板的陰性對照并與LAMP 法進行比較。反應結束后將另一側預先滴加的SYBR Green I 熒光染料與擴增產物緩慢混勻并于自然光和紫外燈下觀察，并用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物分析。

1.5 敏感性檢測

將C83903（LT+）菌株過夜培養后的新鮮菌液作為模板，進行平板計數，調整初始菌液濃度至8×106cfu/mL，10 倍倍比稀釋至8×101cfu/mL，隨后繼續稀釋至濃度為40、20、10 cfu/mL 共9 個稀釋度；分別吸取2 μL 稀釋后的菌液作為模板進行CPA 敏感性擴增試驗，同時與LAMP 和qPCR 擴增結果進行比較。

1.6 人工污染生豬肉樣本的檢測

分別應用CPA、LAMP 和qPCR3 種方法對46 份經產腸毒素大腸埃希氏菌人工隨機污染的生豬肉樣本進行檢測，用DNA 提取試劑盒對生豬肉樣本進行處理并提取DNA 基因組作為模板，CPA 和LAMP 的擴增產物經濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳作用后，并與qPCR 反應結果進行比較。

2 結果

2.1 檢測方法的建立與優化

本研究應用的CPA 引物具有良好的特異性，可在60 min 內60 ℃條件下完成對LT 毒素基因的大量擴增，經2%瓊脂糖電泳后，陽性產物呈不規則梯形條帶，而陰性對照無條帶。CPA 擴增結果見圖1。

圖1 CPA擴增結果Fig.1 Result from CPA amplification

將華峰管內另一側的SYBR Green I 染料與反應產物緩慢混勻后，肉眼觀察陽性管內呈現綠色，陰性呈淡橙色；紫外燈下觀察，陽性管內呈現綠色熒光，而陰性管顏色無變化。

LAMP 和CPA 反應條件的優化結果見圖2。

圖2 LAMP和CPA反應條件的優化Fig.2 Optimization for CPA amplified condition

本研究對CPA 的反應溫度、Bst 聚合酶濃度、dNTPs 濃度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度和擴增時間分別進行了優化，結果可見在62、64 ℃和66 ℃條件下均可產生梯狀條帶，故選擇62 ℃為最優擴增溫度；使用8 U/管Bst 聚合酶濃度擴增時產生梯狀條帶最清晰，故選擇8 U/管為最優濃度；dNTPs 濃度為0.3 mmol/L 擴增產生的條件最清晰；隨著反應的進行，于45 min 時出現清晰明亮的梯形條帶，隨著反應時間的增加條帶亮度變化不明顯，故選擇45 min 為最優擴增時間。根據以上原則CPA 反應的Mg2+濃度和甜菜堿濃度最優值分別為2.0 mmol/L 和0.8 mol/L。

2.2 特異性試驗

LAMP 和CPA 特異性試驗結果見圖3。

用上述優化的CPA 方法分別對14 株不同菌株進行特異性檢測，且重復3 次。瓊脂糖電泳結果表明，CPA 法檢測出攜帶大腸桿菌LI+基因菌株2 株，其他12 株為非攜帶LI+基因菌株，與LAMP 檢測結果一致，說明建立的CPA 法具有高特異性。

2.3 敏感性試驗

LAMP 和CPA 敏感性試驗結果見圖4。

圖3 特異性試驗Fig.3 Specificity test of the reactions

圖4 敏感性試驗Fig.4 Sensitivity test of the reactions

將過夜培養的純菌液濃10 倍稀釋至8×101cfu/mL，隨后稀釋40、20 cfu/mL 和10 cfu/mL 共9 個稀釋度進行敏感性試驗，每個稀釋度重復3 次。瓊脂糖電泳結果如圖4所示，CPA 法與qPCR 法具有相同的檢測靈敏度為40 cfu/mL，而LAMP 法靈敏度為8×101cfu/mL，可見CPA 法的檢測靈敏度較LAMP 法高2 倍。

2.4 人工污染生豬肉樣本檢測結果

分別應用CPA 法和LAMP 法對46 份隨機污染的生豬肉樣本進行快速檢測，以qPCR 結果作為參考。結果可見，CPA 和LAMP 方法共檢測出攜帶LT 陽性基因7 株，與qPCR 法檢測結果一致，且檢出率均為15.2%。

表2 臨床樣本檢測結果Table 2 The detection results of clinical samples

3 結論與討論

本研究成功設計出針對食源性大腸桿菌不耐熱腸毒素全基因保守序列的CPA 特異性引物，通過優化反應溫度、Bst 酶濃度、dNTPs 濃度等參數，建立了一種快速、特異、敏感的新型檢測方法。建立的CPA 法與LAMP 方法相比，二者均具有較高的特異性，從加樣到反應結束整個過程僅需要1.5 h 即可完成對目的基因的特異性擴增，并對非攜帶目的基因菌株檢測呈陰性。敏感性試驗結果可見，與之前報道的LAMP 方法相比[11]，CPA 等溫擴增法和熒光定量PCR 方法具有相同的靈敏度，且較LAMP 法高出2 倍，僅為40 cfu/mL，可滿足低拷貝目的基因的檢測。本研究應用人工污染生豬肉方法模擬食品抽樣檢驗，以熒光定量PCR 結果作為參照，CPA 和LAMP 方法對人工污染生豬肉的陽性檢出率均為15.2%（7/46），說明CPA 作為一種新型的等溫檢測技術，能夠滿足食品衛生行業定性檢驗微生物學的要求。

在CPA 擴增過程中，隨著體系內DNA 的不斷合成會產生大量的焦磷酸鎂沉淀，可根據是否生成白色沉淀判斷反應結果，但本研究對LT 毒素基因擴增時，并未發現管內產生肉眼明顯可見的白色沉淀，只觀察到管內液體為混濁，通過濃度為2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析可見不同大小的區帶階梯式圖譜。同時，為避免在開蓋時反應體系產生的大量氣溶膠污染周圍環境，本研究選擇廣州華峰生物科技有限公司生產的華峰管進行可視化檢測，反應前分別將SYBR Green I 染料和反應體系混合物加入華峰管兩側，反應結束后將二者混合即可判斷反應結果，有效地防止氣溶膠造成的交叉污染。

綜上所述，本研究所建立的CPA 快速檢測產腸毒素大腸桿菌的等溫擴增方法，不僅具有時間短、低成本、高特異性和高特異性的特點，而且不需要依賴特殊的、精密昂貴的儀器設備和嚴格的試驗條件，為食源性致病菌檢測提供了新的解決思路，在感染性疾病診斷和食品衛生檢驗等領域具有廣闊的應用前景。