獼猴桃根石油醚提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性及GC-MS成分分析

聶昌平，吳丹，楊俊，萬路平，梁光平，*

（1.遵義醫(yī)藥高等專科學校，貴州遵義563006；2.遵義市第五人民醫(yī)院，貴州遵義563000）

獼猴桃根來源于獼猴桃科植物獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）的根或根皮，主要分布于我國陜西、江西、湖南、湖北、福建、浙江、河南、安徽等省，具有活血消腫、祛風利濕、清熱利尿、散熱止血的功效[1]。獼猴桃根成分類型主要有三萜、黃酮、甾體、蒽醌、酚酸、木質素、揮發(fā)油、糖類、鞣質、香豆素、生物堿、脂肪等[2]。現代藥理學研究表明，獼猴桃根具有抗腫瘤[3-5]、抗氧化[6]、抗血栓[7]、增強免疫力[8-9]以及抗病毒[10-11]作用。前期研究還發(fā)現[12]，獼猴桃根乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。而α-葡萄糖苷酶在人類的糖原降解和動物、植物、微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能[13]。同時，α-葡萄糖苷酶抑制劑也是作為治療糖尿病的首選藥物，被視為最具臨床治療應用價值的降血糖藥物[14]。為進一步挖掘獼猴桃根在防治糖尿病方面的價值，本研究對獼猴桃根石油醚提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行研究，采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析檢測獼猴桃根石油醚提取物的組成成分，為獼猴桃根的開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃根：貴州省遵義市新蒲新區(qū)蝦子鎮(zhèn)，經遵義醫(yī)藥高等專科學校張學愈副教授鑒定為獼猴桃科植物中華獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）的根或根皮，樣本存放于遵義醫(yī)藥高等專科學校藥學系。

α-葡萄糖苷酶（500 000 U/g）：日本OSAKA BIO 公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）：Sigma 公 司 ； 阿 卡 波 糖（acarbose）：德國拜耳公司；石油醚（60 ℃～90 ℃）、三氟化硼、氫氧化鈉、甲醇、正庚烷、二氯甲烷、二甲基亞砜、磷酸鉀、碳酸鈉、氯化鈉：阿拉丁試劑公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HP6890/5975C 型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；Max-190 型酶標儀：美國Molecular Devices公司；N-1100V-W/WD 型旋轉蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會社；96 孔細胞培養(yǎng)板：美國Cambridge MA 公司；DZF-1 型真空干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；D7031EASYpure II 超純水機：巴恩斯特德國際有限公司；SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱：浙江力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的提取

取獼猴桃根粗粉150 g 于圓底燒瓶，加入300 mL石油醚（60 ℃～90 ℃），加熱回流提取3.0 h，靜置冷卻，過濾，減壓濃縮，干燥得22.3 g 提取物。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶活性檢測

設置1、2、20、50、100 μg/mL 5 個濃度。反應體系[9]：80 μL 磷酸鉀緩沖液（pH 6.9）中依次加入10 μL α-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL），指定濃度的樣品溶液10 μL，37 ℃恒溫反應10 min，加入20 μL PNPG（2.5 mmol/L），37 ℃繼續(xù)恒溫15 min，加入40 μL Na2CO3溶液（1 mol/L）終止反應，于405 nm 波長下測定吸光度（A）。阿卡波糖為陽性對照，同時設定空白對照（只加緩沖液）和陰性對照（只加緩沖液和酶液）。酶活性抑制率按下式計算：

1.3.3 提取物供試液的制備

1.3.3.1 非甲酯化樣品

取獼猴桃根石油醚提取物18 mg，加入5 mL 二氯甲烷溶解，微孔濾膜過濾，濾液備用。

1.3.3.2 甲酯化樣品

稱取提取物22 mg，放入密閉瓶中，加入2 mL 氫氧化鈉甲醇溶液（2%），80 ℃恒溫反應0.5 h，加入1.75 mL三氟化硼甲醇溶液（15%），繼續(xù)恒溫反應2 min。停止加熱，取出密閉瓶，加水少量，迅速冷卻至室溫。準確加入2 mL 正庚烷，振搖2 min，再加入氯化鈉至飽和，靜置分層，取上層溶液到進樣瓶，備用。

1.3.4 非甲酯化樣品的氣相色譜條件

色譜柱為FB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，初始溫度58 ℃（保留2 min），以6 ℃/min升溫至310 ℃，保持10 min，運行時間54 min，氣化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999 %），柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，分流比20∶1，溶劑延遲時間4.0 min。

1.3.5 甲酯化樣品的氣相色譜條件

色譜柱為FB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，初始溫度120 ℃（保留2 min），以4 ℃/min 升溫至220 ℃，保持12 min，再以10 ℃/min 升溫至310 ℃，保持6 min，運行時間54 min；氣化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0mL/min，分流比20∶1，溶劑延遲時間7.0min。

1.3.6 質譜條件

離子源為EI 源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 518 V（甲酯化樣品為1 659 V）；接口溫度280 ℃；質量范圍29 amu～500 amu。

1.3.7 定性定量分析

總離子流圖中的各峰與Wiley275 和Nist2014 標準質譜圖進行對照鑒定，用氣相色譜峰面積歸一化法測定各化學成分的相對質量分數。

2 結果與分析

2.1 α-葡萄糖苷酶活性

提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性見表1。

表1 獼猴桃根石油醚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性（x±s，n=6）Table 1 Inhibitory effect on α-glucosidase of petroleum ether extracts from Actinidia chinensis radix（x±s，n=6）

由表1可知，提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率與濃度呈正相關，具有濃度依賴性，在50、100 μg/mL 濃度下可抑制作用能顯著地抑制α-葡萄糖苷酶的活性。在最大考察濃度時，提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率可達（89.38±1.27）%，優(yōu)于相同濃度下阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率（49.57±2.28）%。

2.2 GC-MS結果及分析

2.2.1 非甲酯化樣品

非甲酯化樣品的總離子流圖見圖1。

圖1 非甲酯化樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion flow chart of components in non-methyl esterification sample

對總離子流圖中的信號峰進行系統(tǒng)檢索及Nist2005 和Wiley275 標準質譜圖核對，共檢測出37種成分，鑒定出29 種，占流出峰總面積的93.55%，其中包括12 個酯類（77.11%）、12 個醛酮類（11.18 %）、3 個醇類（4.83%）、2 個呋喃（0.43%），各組分的鑒定結果見表2。

由表2可知，獼猴桃根石油醚提取物主要成分為（按相對含量多少排序）酯類：油酸乙酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸甲酯、硬酯酸乙酯、亞油酸甲酯，相對含量分別為37.30%、14.69%、9.50%、5.32%、4.70%、2.48 %。醛酮類：（E）-2-癸烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、（E）-2-庚烯醛、（E，Z）-2，4-癸二烯醛、（E）-2-十一烯醛、（E，E）-2，4-壬二烯醛，相對含量分別為3.46%、2.24%、1.52%、1.22%、0.85%、0.60%。醇類僅松柏醇相對含量較高，為4.21 %，其余化合物含量較低。

2.2.2 甲酯化樣品結果分析

甲酯化樣品的總離子流圖見圖2。

表2 獼猴桃根石油醚提取物揮發(fā)性成分GC-MS分析結果Table 2 GC-MS analysis of volatile oils of petroleum ether extracts from Actinidia chinensis radix

檢出的24 種成分與Nist2005、Wiley275 標準質譜圖庫對比檢索后，從中鑒定了20 種，油酸甲酯（46.01 %）、亞油酸甲酯（31.81 %）、棕櫚酸甲酯（13.22 %）和硬酯酸甲酯（5.45%）4 種脂肪酸的相對含量較高，占檢出所有成分的96.48%，各組分的鑒定結果如表3所示。

圖2 甲酯化樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion flow chart of components in methyl esterification sample

表3 獼猴桃根石油醚提取物甲酯化樣品的GC-MS 分析結果Table 3 Analysis of components in methyl esterification sample

2.2.3 甲酯化與非甲酯化樣品成分對比

對比表2和表3可知，油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬酯酸甲酯、辛酸甲酯為共有成分，但它們在甲酯化和非甲酯化樣品中的相對含量存在差異，以油酸甲酯的差異最大，亞油酸甲酯次之。油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬酯酸甲酯、辛酸甲酯在獼猴桃根石油醚提取物中是否同時以酯類和羧酸形式存在，有待通過標準物質對照進行核實。

3 結論與討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑是治療糖尿病的首選藥物，與胰島素及其他口服降糖藥相比，α-葡萄糖苷酶抑制劑能有效阻止糖尿病患者餐后血糖迅速升高，使血糖維持在一定水平，減少血糖對胰腺的刺激，從而有效預防并改善糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[12]。在前期研究的基礎上，對獼猴桃根石油醚提取物的α-葡萄糖苷酶抑制作用及化學組成深入分析。結果表明，獼猴桃根石油醚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有濃度依賴性，在最大考察濃度時，提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率可達（89.38±1.27）%。采用GC-MS 對獼猴桃根石油醚提取物的組成進行了分析，從非甲酯化樣品中鑒定出29 種成分，從甲酯化樣品中鑒定出20 種成分。其中，油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬酯酸甲酯、辛酸甲酯在甲酯化和非甲酯樣品中都被鑒定出。這5 種成分在獼猴桃根石油醚提取物中是否同時以酯類和羧酸形式存在，有待通過標準物質對照進行核實。

據文獻報道，亞油酸及其酯類具有降血糖作用[15-16]，而降血糖作用與抑制α-葡萄糖苷酶的活性有關。結合本研究GC-MS 對獼猴桃根石油醚提取物的成分分析結果，推測獼猴桃根石油醚提取物具有降血糖作用的物質基礎可能是亞油酸、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯等成分。