4種檢測方法對巧克力中亞利桑那沙門氏菌的檢測結果比較

張紅莉，李勇，許均華，鄭文，徐文泱，歐露真，代洪梅

（1.郴州市食品藥品檢驗檢測中心，湖南郴州423000；2.郴州市疾病預防控制中心，湖南郴州423000；3.湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南長沙410111）

沙門氏菌是人畜共患病原菌之一，菌體溶解時，其細胞壁所含的脂多糖釋放出來，形成內毒素[1]，可引起傷寒與副傷寒（腸熱癥）、慢性腸炎、敗血癥、食物中毒等。目前已經發現近3 000 個種[2]，確認的沙門氏菌血清型有2 579 種[3]，每年全球因食品中沙門氏菌污染而引起的感染病例數以億計，在世界范圍內引起的食物中毒病例中常常排在首位[4-5]，目前也有文獻報道亞利桑那沙門氏菌感染人類致病的案例[6-8]。

由于亞利桑那沙門氏菌表型和生化反應極不穩定，因此明確其最優檢測方法在食品安全檢驗中顯得尤為重要。目前常用的檢測方法有：利用生化反應的常規檢驗方法，如傳統生化國標法[9]、VITEK 全自動微生物鑒定系統[10]等；利用VIDAS 的酶聯免疫技術的法[11-12]等；利用分子生物學實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）等[13]；利用蛋白質譜圖基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜法[14-16]等。各方法都存在一定的利弊，本實驗室在2018年的中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNCA）“巧克力中沙門氏菌檢驗”中應用實時熒光PCR、VITEK 2、API 20E和GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》4 種不同的檢測方法，分析比較其亞利桑那沙門氏菌檢測效果。

1 材料與方法

1.1 儀器設備及試劑

實時熒光PCR7500：美國ABI 公司；VITEK 2 全自動微生物鑒定系統、API LAB 軟件：法國生物梅里埃公司。

細菌DNA 提取試劑盒、沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）：中山大學達安基因股份有限公司。VITEK 2 21341 革蘭氏陰性細菌鑒定卡（GN 卡）、API 20E 試劑盒：法國生物梅里埃公司。

緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（tetrathionate broth base，TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（seleite cystine broth，SC）增菌液、亞硫酸鉍（bismuth sulfite，BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（xylose lysine desoxycholate，XLD）瓊脂、HE（hektoen enteric）瓊脂、三糖鐵（triple sugar iron，TSI）瓊脂、營養瓊脂（nutrient agar，NA）、鄰硝基酚 β-D 半乳糖苷（2-nitrophenyl β-D-galactopyranoside，ONPG）、沙門顯色平板A、沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒：北京陸橋技術股份有限公司；沙門氏菌顯色培養基B：法國科馬嘉；沙門診斷血清：泰國S&A。

樣品來源：中國合格評定委員會提供的含亞利桑那沙門氏菌的巧克力樣本。

1.2 試驗方法

1.2.1 實時熒光PCR 法

1.2.1.1 DNA 提取

把巧克力（NIFDC-PT-135）樣品接種于45 ℃BPW緩沖蛋白胨水中融化后于36 ℃培養18 h，各取1 mL培養物接種10 mL TTB 于42 ℃培養24 h 和10 mL SC于36 ℃培養24 h。取1 mL 培養液于13 000 r/min 離心3 min，吸棄上清，用1 mL 已滅菌的ddH2O 懸浮，13 000 r/min 離心3 min，吸棄上清，重復上述步驟兩次，加入含有200 μL 細菌裂解液瞬時離心后，將含有菌液的離心管沸水浴10 min 后，冷卻2 min，13 000 r/min 離心10 min。取上清液備用。陰性質控和陽性質控品操作步驟同上，且參與提取，用于對環境進行監控。

1.2.1.2 實時熒光PCR 反應體系和參數

實時熒光PCR 反應體系為20 μL：17 μL Salm PCR反應液A（特異性引物、探針、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液等）+3 μL Salm PCR 反應液B（熱啟動Taq 酶、UDG 酶等）。實時熒光PCR 反應參數為：50 ℃，2 min，95 ℃預變性15 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火延伸45 s，同時收集FAM 熒光，進行40 個循環，反應結束。

實時熒光PCR 結果判定：如果羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，FAM）檢測通道無擴增曲線或Ct值＞38，可判樣品為沙門氏菌陰性；如果FAM 檢測通道Ct 值≤38，且曲線有明顯的擴增，可判樣品為沙門氏菌陽性。

1.2.2 VITEK 法

樣品按GB4789.4-2016 經過選擇性瓊脂平板增菌，經TSI、賴氨酸脫羧酶初步生化確定為疑似沙門氏菌后，將菌落純化，配制成菌懸液，充填到GN 卡內，封口后放入測試槽內，讀取每小時卡片內細菌在各孔培養基內生長變化值，5 h～8 h 后出具結果。

1.2.3 API 20E 法

樣品按GB4789.4-2016 經過選擇性瓊脂平板增菌，經TSI、賴氨酸脫羧酶初步生化確定為疑似沙門氏菌后，將菌落純化，配制成菌懸液，接種于試劑條，于36 ℃培養18 h～24 h，觀察生化反應結果。根據APILAB軟件得到鑒定結果。

1.2.4 GB 4789.4-2016 法

根據GB 4789.4-2016 操作步驟進行，同時分別選擇A 和B 兩種顯色培養基進行選擇性分離后，用生化測試盒和血清做后續的鑒定步驟。

1.2.5 血清學試驗

于潔凈載玻片的測試區域及對照區域分別滴一滴抗血清和一滴生理鹽水，用鉑金絲沾取新鮮培養物單菌落一環，于載玻片上的抗血清和生理鹽水中，分別將培養物和抗血清、培養物和生理鹽水充分混勻，來回傾斜晃動載玻片30 s～1 min，觀察凝集現象：O 抗原為顆粒狀凝集；H 抗原為絮狀或絨毛狀凝集。

2 結果和分析

2.1 實時熒光PCR法檢測結果

取1 mL 增菌液提取DNA 用于實時熒光擴增，結果如圖1所示。增菌液擴增出陽性擴增曲線。

2.2 VITEK 2法鑒定結果

全自動微生物鑒定系統VITEK 2 鑒定結果見表1。

全自動微生物鑒定系統VITEK 2 分析結果為：腸沙門菌雙相亞利桑那亞種Salmonella entericassp.diarizonae概率為98%，置信度極好。

2.3 API 20E法鑒定結果

腸桿菌和其它革蘭氏陰性桿菌鑒定系統API 20E鑒定結果見表2。

API LAB 軟件分析結果為：豬霍亂沙門菌亞利桑那亞種Salmonella choleraesuisssp.arizonae的概率為89%，被鑒定菌株與標準菌株的相似程度為0.64。

圖1 亞利桑那沙門氏菌實時熒光PCR擴增圖譜Fig.1 Amplification pattern of Salmonella arizonae by real-time PCR

表1 樣品在GN卡中的生化反應結果Table 1 The biochemical reaction results of the sample in GN card

表2 樣品在API 20E試條中的生化反應結果Table 2 The biochemical reaction results of the sample with API 20E system

2.4 GB4789.4-2016法鑒定結果

采用國標GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》對樣品增菌液培養后再平板劃線分離，由于沙門顯色培養基的成分屬于廠家保密范疇，所以同時采用了A、B 兩個廠家的培養基進行生化鑒定，結果如表3所示。

表3 雙相亞利桑那沙門氏菌在各種選擇性培養基上的菌落特征Table 3 Colony characteristics of Salmonella arizonae in different culture mediums

雙相亞利桑那在XLD、HE、沙顯A 上的菌落都為非典型形態，BS、沙顯B 上的菌落形態特征明顯，尤其是沙顯B 的金屬藍菌落，可以直接初判為乳糖陽性的沙門氏菌。此疑似陽性菌進一步做初步生化，生化反應鑒定結果見表4。

表3和表4結果符合GB 4789.4-2016 反應序號A3 的生化結果，應補做鄰硝基酚β-D 半乳糖苷（2-nitrophenyl β-D-galactopyranoside，ONPG）生化鑒定，標準判讀為ONPG 陰性為沙門氏菌，但實際檢測結果ONPG 為陽性，標準并未給出結論。

進一步做沙門氏菌生化群的鑒別，鑒定結果如表5。

表4 生化試驗鑒定結果Table 4 The results of biochemical

表5 生化試驗鑒定結果Table 5 The results of biochemical

以上鑒定結果符合生化群Ⅲ的特征，需進一步血清學確認。

2.5 血清學確認

對3 種方法 （VITEK 2、API 20E 和GB 4789.4-2016）分離出的疑似沙門氏菌進行血清學凝集試驗，血清分型結果為：Ⅲb，菌體O 抗原：60+++；Vi 不凝集；鞭毛H 抗原凝集，H1 相為：r+++，經誘導H2 相為：e+++，n+++，x+++，Z15+++[17]。

2.6 分析比較4種方法的優劣

從準確性、檢測步驟、耗時上比較了4 種檢測方法對巧克力中亞利桑那沙門氏菌的檢測，見表6。

表6 4種檢測方法對巧克力中亞利桑那沙門氏菌的優劣比較Table 6 Comparison of the detection results of Salmonella arizona in chocolate by four methods

在準確性上：1）PCR 法檢出為沙門氏菌陽性，可鑒定到屬；2）VITEK 和API 20E 法結果都可鑒定到亞種，VITEK 結果為腸沙門菌雙相亞利桑那亞種Salmonella enterica ssp.diarizonae%id：98，API 20E 結果為：豬霍亂沙門菌亞利桑那亞種Salmonella choleraesuisssp.arizonae%id 為89.0，根據血清分型：最終確認為：雙相亞利桑那亞種，與VITEK 法檢驗結果一致；3）GB4789.4-2016 法前期的生化鑒定結果不能完全確定是不是沙門氏菌，必須結合文獻血清學鑒定[17]綜合分析，這是由于亞利桑那沙門氏菌表型和生化反應極不穩定，因此傳統國標法受限較大。而由此可見VITEK 法優于API 20E、實時熒光PCR 法、GB4789.4-2016 法。

由表6可知，操作步驟和時耗上實時熒光PCR 法優于VITEK 法優于API 20E 優于GB4789.4-2016 法。

3 結論與討論

雙相亞利桑那亞種沙門氏菌寄生于冷血動物的腸道內，可引起人和其他動物感染，國內雖有人感染雙相亞利桑那亞種的報道，但由于血清價格昂貴，分型繁雜，診斷血清（A-F）群O 血清和Vi 因子均不凝集，給明確診斷帶來了極大的困難。

通過上面4 種檢驗方法表明，實時熒光PCR 法操作步驟最簡單，耗時短，效率高，但是該法只鑒定到種，可作為微生物檢驗的輔助快篩方式，針對雙相亞利桑那亞種沙門氏菌的鑒定，VITEK 法優于API 20E和GB4789.4，該法操作簡便，檢驗周期時短，可直接鑒定到型，且更精準。但由于雙相亞利桑那亞種沙門氏菌表型和生化反應極不穩定，在沙顯A 和XLD 上呈現非典型生化特征，極易與大腸埃希菌、枸櫞酸桿菌混淆，所以檢測過程需要結合分子生物PCR、VITEK、API 20E、GB4789.4-2016 和血清學五者進行綜合診斷判別，否則漏檢的幾率很大。