尖葉假龍膽對脂多糖誘導膿毒癥模型大鼠急性腎損傷的保護作用研究*

李 冀 高博文 崔言坤 高彥宇

（黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

尖葉假龍膽 （Gentianella Acuta）為龍膽科（Gentiananceae）假龍膽屬（Gentianella Moench），味苦、性涼，全草入藥，有清熱利濕之效，而蒙藥名為地格達，在藏語中亦為苦之意［1-2］。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細胞外膜的主要成分，是引起膿毒癥及與其有關的急性腎損傷的重要原因［3］。而中醫學中并沒有與膿毒癥急性腎損傷相對應的概念，根據“高熱”“小便不利”等主要臨床特征，毒（痰、瘀、火熱、濕濁）邪內蘊為其發病關鍵，加之因虛至實的病機特點，中醫治療當以益氣清熱解毒［4-5］。本實驗以腹腔注射LPS造模，通過檢測大鼠血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及尿中腎組織腎損傷分子-1（KIM-1）、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）水平等，觀察尖葉假龍膽對大鼠膿毒癥急性腎損傷模型的保護作用，為臨床治療提供相應的理論依據?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠32只，雄性，體質量（200±20）g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK（黑）2017-001。

1.2 試藥與儀器 尖葉假龍膽（由黑龍江中醫藥大學方劑實驗室提供）；LPS（批號 L2880，Sigma 公司）；Scr、BUN測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；KIM-1、NGAL ELISA試劑盒購于上海藍基有限公司；地塞米松（廣東華南藥業集團有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma公司）；酶標儀（Tecan INFINITE 200 PRO）；紫外分光光度計（島津 UV2550）；離心機（Hettich 2205）。

1.3 分組與造模 將32只大鼠隨機分為尖葉假龍膽組、地塞米松組、模型組與空白組，每組8只。尖葉假龍膽組、地塞米松組與模型組腹腔注射LPS（7 mg/kg）制備大鼠膿毒癥急性腎損傷模型［6］，空白組腹腔注射同體積0.9%氯化鈉注射液，造模后24 h取材。

1.4 干預方法 尖葉假龍膽由10倍量水浸泡后回流提取2 h，濾渣加10倍量75%乙醇回流提取2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮成含生藥量1 g/mL的藥液，備用。尖葉假龍膽組大鼠造模前7 d連續灌胃給藥，給藥量為3 g/（kg·d），同時間段空白組灌胃給予等量蒸餾水；地塞米松組造模前1 h腹腔注射給藥地塞米松（5 mg/kg）。

1.5 標本采集與檢測 1）一般情況與尿量：造模后將各組大鼠放入代謝籠中收集尿液，并進行一般狀況觀察，計算 24 h尿量變化。2）血清 Scr、BUN：各組在造模后24 h，1.5%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心（3 000 r/min，5 min，4 ℃）取上清液測 Scr、BUN 水平。 3）尿 KIM-1、NGAL 水平：代謝籠中收集的尿液，離心（1 000 r/min，15 min，4 ℃）收集上清液，采用酶聯免疫吸附測定檢測，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量數據以（±s）表示，多組均數采用單因素方差分析，兩兩組間比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況 造模前各組大鼠狀態良好，24 h尿量穩定。造模后模型組大鼠呼吸頻率加快，尿少、色深、豎毛、戰栗等癥狀。尖葉假龍膽組與地塞米松組比較癥狀顯著減輕，但對刺激反應較靈敏。

2.2 各組大鼠治療24 h后尿量及血清Scr、BUN水平比較 見表1。24 h時模型組尿量、血清Scr與BUN與空白組差異有統計學意義 （P＜0.01）；尖葉假龍膽組、地塞米松組尿量變化、血清Scr和BUN與模型組差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠治療24 h后尿量、血清Scr、BUN水平比較（x±s）

表1 各組大鼠治療24 h后尿量、血清Scr、BUN水平比較（x±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n BUN（mmol/L）尿量（mL） Scr（μmol/L）空白組 8 4.77±0.69模型組 8 30.50±1.69*地塞米松組 8 17.21±1.29△3.14±0.31 58.05±3.21 8.16±0.44* 85.96±6.35*5.18±0.60△ 70.02±2.85△尖葉假龍膽組 8 25.00±1.98△5.01±0.37△ 74.63±3.89△

2.3 各組大鼠治療24 h后尿液中KIM-1、NGAL水平比較 見表2。24 h時模型組尿液中KIM-1、NGAL含量與空白組差異有統計學意義（P＜0.01）；尖葉假龍膽組、地塞米松組尿液中KIM-1、NGAL含量與模型組差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

膿毒癥（Sepsis）作為危及生命的器官功能障礙疾病，死亡率極高且病死率在不斷增長。膿毒癥的病理生理機制非常復雜，是引起急性腎損傷（AKI）最主要原因，并發癥稱為膿毒癥急性腎損傷（SAKI），SAKI約占所有病因引起AKI的50%，且30%～50%的膿毒癥患者發生AKI［7-10］。前期研究表明LPS能夠導致膿毒癥性急性腎損傷［11］，LPS誘導的動物模型具有易復制、較高的血清細胞因子等優勢，其中腹腔注射比靜脈注射更易復制高動力循環的特點［12］。血清中的Scr和BUN主要反映了腎小球的濾過功能，故常作為檢測腎功能的生化指標［13-14］，實驗中較之模型組，尖葉假龍膽尖葉假龍膽組降低了血清中Scr、BUN的水平，一定程度上反映了其對該模型的保護作用。KIM-1是一種跨膜糖蛋白，在正常肝、腎、脾中微量表達，而在受損后再生的近曲小管上皮細胞中表達顯著增強，并呈時間依賴性。其細胞外域可裂解為可融性片段釋放入細胞外，并最終排入尿中，參與免疫耐受反應過程，影響了T細胞分化及巨噬細胞的活化［15］，故具有良好的特異性與敏感性［16-18］。NGAL則作為一種損傷誘導的轉鐵蛋白，通過改善細胞內輔酶鐵的代謝來調節多種參與細胞生命重要蛋白質的合成，在腎臟損傷（上皮細胞受損）時上調并釋放，故尿液NGAL是AKI早期損傷的敏感標志物［19-20］。近年常把KIM-1與NGAL作為急性腎小管損傷的兩種標志，同時作為該研究的檢測指標。尖葉假龍膽組顯著降低了尿中KIM-1與NGAL水平。而地塞米松作為經典傳統的糖皮質激素類藥物，具有很好的抗炎和免疫抑制作用，因其生理劑量及應激劑量可以上調腎組織中表達，減輕膿毒癥引起的腎組織損傷，作用明顯優于大劑量［21］，因此選其作為陽性藥對照組。綜上所述，我們的研究表明，尖葉假龍膽對LPS誘導的大鼠急性腎損傷模型起到一定的保護作用，可能與抑制KIM-1與NGAL蛋白有關，相關通路及機制將作為下一階段的研究方向。

表2 各組大鼠治療24 h后尿液中KIM-1、NGAL水平比較（ng/mL，x±s）

表2 各組大鼠治療24 h后尿液中KIM-1、NGAL水平比較（ng/mL，x±s）

組 別 n KIM-1 NGAL空白組 8模型組 8地塞米松組 8 1.57±0.18 2.45±0.15 16.04±0.29* 14.50±0.29*9.31±0.48△ 6.98±0.27△尖葉假龍膽組 813.23±0.33△ 7.26±0.22△