清熱活血方對(duì)心梗后心室重構(gòu)的作用及對(duì)多胺相關(guān)蛋白ODC、SSAT表達(dá)的影響*

趙新軍 李 榮 吳 偉 卿立金 羅川晉 褚慶民 李 靖 都治伊 邱藝俊

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

心梗后心室重構(gòu)（VR）是指急性心肌梗死（AMI）后心臟在受到損傷狀態(tài)下，出現(xiàn)心肌細(xì)胞適應(yīng)不良性肥大、心肌細(xì)胞凋亡和心肌細(xì)胞外基質(zhì)纖維化，引起心室形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能等發(fā)生一系列的改變［1-2］。VR的進(jìn)一步發(fā)展是并發(fā)心衰甚至心源性死亡的最重要的因素之一。多胺是一組脂肪胺類小分子化合物，由腐胺（putrescine）、精脒（spermidine）、精胺（spermine）組成，在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分化中發(fā)揮作用。心肌梗死后神經(jīng)內(nèi)分泌的過(guò)度激活是導(dǎo)致VR的主要原因［3］，而神經(jīng)內(nèi)分泌的過(guò)度激活則可以引起多胺代謝平衡的嚴(yán)重紊亂。證據(jù)表明，多胺在心臟疾病的各個(gè)方面起著重要的作用［4］。

本課題組在臨床工作中總結(jié)出AMI發(fā)生的主要病機(jī)可能是熱毒血瘀［5］，提出了“清熱活血”的治療原則，并由此在陳可冀院士冠心2號(hào)方基礎(chǔ)上創(chuàng)立了清熱活血方。研究表明，清熱活血方能改善AMI后患者的臨床證候積分［6］，能改善梗死后左室結(jié)構(gòu)和功能［7］。既往清熱活血方主要側(cè)重于臨床療效研究，本實(shí)驗(yàn)側(cè)重基礎(chǔ)研究，觀察清熱活血方對(duì)多胺及其相關(guān)蛋白的影響，從而探索清熱活血方改善心肌梗死后VR的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠70只，質(zhì)量180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（粵）2013-0034。大鼠生活在無(wú)致病菌的環(huán)境中，大鼠可在恒溫20～22℃的房間內(nèi)自由取水，并有12 h∶12 h的光-暗循環(huán)。所有涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的程序都是按照廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用機(jī)構(gòu)委員會(huì)的指導(dǎo)方針進(jìn)行的。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，允許大鼠適應(yīng)新環(huán)境1周。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：腐胺（上海亨代勞儀器有限公司，批號(hào)333-93-7）、亞精胺（又名精脒，上海亨代勞儀器有限公司，批號(hào)124-20-9）、精胺（上海亨代勞儀器有限公司，批號(hào)71-44-3）、鳥氨酸脫羧酶抗體（santa cruz公司）、精脒/精胺N1-乙酰基轉(zhuǎn)移酶抗體（santa cruz公司）。培哚普利（施維雅制藥有限公司，批號(hào) H20034053）；2）儀器：心臟彩超機(jī)（飛利浦 IE33，德國(guó)飛利浦公司）、小型動(dòng)物呼吸機(jī)型號(hào)（SAR-830，上海寰熙醫(yī)療）。

1.3 模型制備 隨機(jī)選取60只大鼠進(jìn)行心梗造模。方法參照文獻(xiàn)并適當(dāng)改進(jìn)［8］。以100 g/L水合氯醛腹腔注射（0.3 mL/100 mg）麻醉大鼠。左側(cè)胸部備皮，大鼠固定于弓形木板上，充分暴露頸部氣管，使用激光筆照射大鼠頸部，采用自制的導(dǎo)管經(jīng)口氣管插管，成功后接呼吸機(jī)，采用容量控制模式，潮氣量約3 mL/100 g，頻率為75次/min，觀察大鼠胸廓起伏，并微量調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)。呼吸穩(wěn)定后，沿左側(cè)胸部第3、4肋間開胸，暴露心臟，撕開心包膜，棉簽撥開胸腺和左心耳，左冠狀動(dòng)脈起源點(diǎn)下1～2 mm處，使用6-0無(wú)損傷縫線在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間縫扎冠狀動(dòng)脈左前降支。結(jié)扎后連接心臟電生理記錄儀。心肌梗死成功的標(biāo)志為：標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)Ⅱ?qū)T段抬高，肉眼觀察結(jié)扎區(qū)變白或變灰色，迅速將心臟放回胸腔，隨即分層縫合肌肉和皮膚，將胸腔內(nèi)的空氣及血液抽盡，并給予術(shù)口消毒。術(shù)后每隔15 min復(fù)查一次心電圖，如連續(xù)2次ST段抬高即為AMI造模成功。假手術(shù)組縫線僅穿過(guò)冠狀動(dòng)脈而不結(jié)扎，其余操作與AMI模型組動(dòng)物相同。術(shù)后予青霉素8萬(wàn)U，肌肉注射，每日1次，共3 d。隨機(jī)選取60只大鼠進(jìn)行心梗造模。造模1周后行心臟彩超檢查。

1.4 分組方法 排除造模不成功的大鼠6只，以及1周內(nèi)死亡的4只，將剩余50只造模成功的大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，另設(shè)假手術(shù)組，共6組，包括假手術(shù)組、模型組、培哚普利組、清熱活血方高劑量組、清熱活血方中劑量組、清熱活血方低劑量組。

1.5 干預(yù)方法 清熱活血方及培哚普利均為根據(jù)成人劑量計(jì)算得到的大鼠1倍生物等效劑量。清熱活血方的制備及質(zhì)量控制：川芎、赤芍、降香、紅花、丹參、黃芩、毛冬青，按照 10∶12∶10∶10∶30∶15∶30 的比例。 將藥物置于砂鍋中，加入相當(dāng)于藥材體積8倍量的水浸泡2 h，煮沸30 min，過(guò)濾藥液；再加入5倍量的水繼續(xù)煮沸20 min，過(guò)濾，合并兩次濾液，將藥液濃縮至含生藥濃度1 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩Ｅ噙崞绽M灌胃濃度0.41 mg/kg，清熱活血方高劑量組灌胃濃度 30 g/（kg·d），清熱活血方中劑量組灌胃濃度15 g/（kg·d），清熱活血方低劑量組灌胃濃度7.5 g/（kg·d），每日分2次灌胃。假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，連續(xù)給藥8周。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）心臟超聲動(dòng)態(tài)觀察大鼠心臟結(jié)構(gòu)變化。于術(shù)后第8周檢測(cè)多普勒超聲心動(dòng)圖，探頭頻率為12 MHz，采用標(biāo)準(zhǔn)的左室長(zhǎng)軸切面，同時(shí)記錄心電圖，觀察心臟的形態(tài)、室壁運(yùn)動(dòng)幅度［9］。2）采用高效液相色譜法檢測(cè)心肌組織多胺的含量：色譜條件和質(zhì)譜條件參考相關(guān)文獻(xiàn)并適當(dāng)改進(jìn)［10］。（1）微透析樣品的前處理：各組動(dòng)物均給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開胸腔取出心臟，在冷的0.9%氯化鈉注射液中漂洗、拭干。快速取左心室150～200 mg，加入0.3 mmol/L冷的高氯酸，在冰水浴中制成勻漿，然后3 500 r/min離心15 min，取其上清液貯存在-80℃冰箱保存。 （2）微透析樣品的處理：微透析樣品（100 μL）置1.5 mL具蓋聚乙烯管中，依次加入IS溶液（100 μg/mL）100 μL，加入 1 mL 乙醚，渦旋 30 s，在 13 000 r/min 離心15 min。取上層有機(jī)相，于40℃下氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?00 μL 甲醇-水溶液（90∶10，v/v）復(fù)溶，渦旋 30 s，取5 μL進(jìn)行UFLC-MS/MS分析。（3）色譜條件和質(zhì)譜條件。色譜條件：Agilent Zorbax XDB-C8色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）。 流動(dòng)相：甲醇-水（90∶10，v/v），流速0.2 mL/min，柱溫為室溫。 進(jìn)樣量：5 μL。 質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源（ESI），正離子掃描方式及多離子反應(yīng)檢測(cè)（MRM）方式檢測(cè)，噴霧電壓為5 500 V，溫度為600℃，氣簾氣20 psi。腐胺、精脒、精胺均選取兩對(duì)離子對(duì)，內(nèi)標(biāo)選取一對(duì)離子對(duì)。（4）儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液。腐胺、精脒、精胺和內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液用甲醇配制，分別含腐胺、精脒、精胺 10.0 μg/mL，內(nèi)標(biāo) 1.0 μg/mL。 工作液由乙醚稀釋各物質(zhì)的儲(chǔ)備液制備，儲(chǔ)備液儲(chǔ)存于-80℃冰箱，工作液儲(chǔ)存于4℃冰箱。3）檢測(cè)多胺系統(tǒng)相關(guān)蛋白鳥氨酸脫羧酶（ODC）、精脒/精胺乙酰基轉(zhuǎn)移酶（SSAT）的表達(dá)。取凍存的心肌組織0.5 g加入1 mL蛋白裂解液 （50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，150 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.1%SDS，25 mmol/L NaF，0.1 mmol/L Na3VO4，100 mg/L PMSF，2 μg/mL leupeptin，1 μg/mL aprotinin），勻漿，離心，取其上清液，分裝保存于-80℃冰箱。Bio-Rad法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)濃度，加入上樣緩沖液 （50 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，2%SDS，10%glycerol，2% β-mercaptoethanol 和 0.5‰ bromophenol blue），10%SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，1×TBS液洗滌3次，加入二抗，37℃孵育，1×TBS液洗滌3次。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，KODAK Image Station 4000 MM圖像系統(tǒng)曝光，分析條帶面積，讀取寬度和灰度值，最后做統(tǒng)計(jì)分析。4）大鼠生存時(shí)間的計(jì)算。大鼠生存時(shí)間以入組后藥物開始干預(yù)當(dāng)天為準(zhǔn)，記錄大鼠存活時(shí)間，以天數(shù)為單位。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，各組均數(shù)比較使用 one-way ANOVA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠生存時(shí)間比較 見表1。8周后，假手術(shù)組無(wú)死亡，模型組死亡5只，死亡率達(dá)50%。培哚普利組、清熱活血方高劑量和中劑量組分別死亡1只，占10%。低劑量組死亡3只，占30%。各組生存時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠生存時(shí)間比較（d，x±s）

表1 各組大鼠生存時(shí)間比較（d，x±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 5培哚普利組 9生存時(shí)間56.00±0.00△△33.40±24.47**51.40±14.55△△清熱活血方高劑量組 9 54.00±6.32△△清熱活血方中劑量組 9 54.40±5.06△△清熱活血方低劑量組 7 43.20±21.71*

2.2 干預(yù)后各組大鼠心功能比較 見表2，圖1。8周后，通過(guò)心臟彩超評(píng)估了各組大鼠的心功能情況。同假手術(shù)組對(duì)比，模型組心功能顯著下降，表現(xiàn)為左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS）顯著降低（P＜0.001 或P＜0.001），左室舒張末內(nèi)徑（LVEDd）和左室收縮末內(nèi)徑（LVEDs）顯著增大（P＜0.001，P=0.001）。與模型組比較，清熱活血方明顯改善了MI后心衰大鼠的心功能。

表2 各組大鼠干預(yù)后心功能比較（x±s）

表2 各組大鼠干預(yù)后心功能比較（x±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 5培哚普利組 9 LVEDd（mm）LVEDs（mm） LVEF（%） LVFS（%）6.23±0.57△△ 3.12±0.44△△ 70.67±7.97△△ 39.22±3.21△△9.97±0.85** 7.58±1.51** 33.18±8.48** 15.00±4.82**7.62±0.61**△ 4.21±0.58*△△ 59.71±12.46**29.21±6.81**△△清熱活血方高劑量組 9 7.42±1.05**△ 4.01±1.02*△△ 53.13±8.39*△△ 28.41±5.56**△△清熱活血方中劑量組 9 7.95±1.41**△ 5.14±0.86** 45.62±9.8**△△ 25.28±7.95**△△清熱活血方低劑量組 7 8.07±1.40**△ 6.54±1.82** 37.41±8.7**△ 24.82±6.71**△△

圖1 各組左心室的二維心臟彩超顯像（成像頻率，12 Hz）

2.3 各組大鼠左室非梗死區(qū)心肌組織中多胺系統(tǒng)相關(guān)蛋白ODC、SSAT表達(dá)的比較 見表3，圖2。與假手術(shù)組對(duì)比，模型組中ODC和SSAT蛋白表達(dá)均有增強(qiáng)；同模型組對(duì)比，培哚普利和清熱活血方不同濃度組均能降低ODC的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。 同時(shí)，清熱活血方治療組也增強(qiáng)了SSAT蛋白表達(dá)，在高劑量組和中劑量組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），低劑量組中無(wú)統(tǒng)計(jì)差異（P＞0.05）。結(jié)果提示：清熱活血方可抑制心肌梗死后ODC的高表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)SSAT的表達(dá)，從而抑制多胺的合成，促進(jìn)精脒和精胺的進(jìn)一步分解，減少總多胺池的含量。

表3 各組左室非梗死區(qū)心肌組織中ODC和SSAT比較（%，x±s）

表3 各組左室非梗死區(qū)心肌組織中ODC和SSAT比較（%，x±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 5培哚普利組 9清熱活血方高劑量組 9清熱活血方中劑量組 9清熱活血方低劑量組 7 ODC SSAT 1.02±0.16△△ 1.07±0.20△△3.57±0.82** 2.16±0.30**1.14±0.28*△△ 3.62±0.63*△△1.14±0.24*△△ 3.48±0.60*△△1.31±0.41*△△ 2.28±0.49*△△2.15±0.46**△△ 2.15±0.30**△△

圖2 各組左室非梗死區(qū)心肌細(xì)胞ODC和SSAT蛋白表達(dá)

2.4 各組左室非梗死區(qū)心肌組織中多胺含量比較見表4。8周后，與假手術(shù)組比較，心肌梗死心衰模型組大鼠的左室非梗死區(qū)心肌細(xì)胞內(nèi)多胺含量仍有較高水平，腐胺、精脒及精胺含量均有增高（均P＜0.001），其中，腐胺含量為假手術(shù)組的4倍左右，精脒含量為假手術(shù)組的3倍左右，精胺含量為2倍左右，總多胺池水平也明顯增加（P＜0.05）。清熱活血方腐胺、精脒及精胺的含量顯著降低，有濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果：清熱活血方干預(yù)后，腐胺、精脒、精胺和總多胺水平均顯著下降。

表4 各組左室非梗死區(qū)心肌組織中多胺含量比較（μg/g，x±s）

表4 各組左室非梗死區(qū)心肌組織中多胺含量比較（μg/g，x±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 5培哚普利組 9腐胺 精脒 精胺 總多胺0.59±0.11△△ 48.91±6.33△△ 37.08±7.63△△ 86.58±14.07△△2.16±0.32** 145.82±8.28** 85.92±2.84** 233.97±60.81**0.89±0.16*△△ 63.99±5.89*△△ 48.21±5.79*△△ 110.69±27.95**△△清熱活血方高劑量組 9 1.37±0.21**△△ 79.29±13.36**△△ 66.12±7.86**△△ 145.92±36.04**△△清熱活血方中劑量組 9 1.40±0.26**△△ 59.50±8.17**△△ 72.60±2.34**△△ 163.49±13.06**△△清熱活血方低劑量組 7 1.85±0.19**△ 110.88±18.35**△△ 75.89±9.61**△ 186.87±48.10**△

3 討 論

當(dāng)前，VR被認(rèn)為是慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)，早期有效地延緩和逆轉(zhuǎn)心梗后VR有著重要的臨床意義。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)藥物干預(yù)心肌梗死后VR的發(fā)生進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，作用機(jī)制的研究已深入到分子細(xì)胞水平，為臨床用藥提供了許多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，但VR發(fā)生的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，故臨床上的治療仍面臨許多挑戰(zhàn)。中醫(yī)在改善VR方面為循證醫(yī)學(xué)提供了較好的補(bǔ)充依據(jù)，臨床上補(bǔ)充了西醫(yī)的不足。

課題組根據(jù)國(guó)家中醫(yī)藥管理局“十一五”重點(diǎn)專科重大疾病診療方案中“熱毒”證素辨證標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)嶺南地區(qū)AMI患者多具有“口氣穢臭、口干口苦，煩熱，大便秘結(jié)，舌紫暗或暗紅，苔黃厚膩，脈弦，滑或滑數(shù)”等熱毒證候表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)顯示熱毒證候表現(xiàn)的患者達(dá)59.9%，表明AMI發(fā)生的主要病機(jī)可能是熱毒血瘀［5］。因此，課題組提出了“清熱活血”的治療原則，并創(chuàng)立了清熱活血方。近年來(lái)，胸痹心痛和真心痛的熱毒血瘀病機(jī)和清熱解毒、活血化瘀法的應(yīng)用逐漸受到臨床醫(yī)師的重視，為治療VR提供了新的思路。

多胺是一種帶有氨基的脂肪胺類物質(zhì)，包括腐胺、精脒、精胺，參與體內(nèi)多種重要的生理和病理過(guò)程，在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)、酶功能及環(huán)磷酸核苷代謝等方面起著重要的作用［11］。ODC是多胺合成的關(guān)鍵酶，經(jīng)過(guò)該酶的催化，鳥氨酸脫羧基形成腐胺，后者是動(dòng)物細(xì)胞合成多胺的限速酶。SSAT為多胺分解代謝的限速酶，具有催化精胺逆轉(zhuǎn)化為精脒以及精脒逆轉(zhuǎn)化為腐胺的作用［12］。研究表明，多胺不僅在孕體發(fā)育、抗衰老、腫瘤以及腦缺血的發(fā)生發(fā)展等方面有重要作用［13］，而且在心血管疾病方面也有明顯的進(jìn)展。多胺在心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。已有研究提示了多胺和心肌肥大之間的關(guān)系，證實(shí)在肥大心肌細(xì)胞的動(dòng)物模型中，心肌細(xì)胞內(nèi)均有ODC活性的高表達(dá)和多胺的過(guò)度聚集［14］。用ODC抑制劑抑制多胺合成，可以通過(guò)減緩異丙腎上腺素誘導(dǎo)的CPK和LDH釋放，從而緩解VR［15］；也有研究表明，在缺血性心臟病導(dǎo)致的心衰患者中，多胺可能是導(dǎo)致心肌纖維化的重要促發(fā)因素［16］。由此可見，在心肌梗死后VR的演變過(guò)程中，多胺可能是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活導(dǎo)致VR的共同通路。

本實(shí)驗(yàn)中，筆者檢測(cè)了左室非梗死區(qū)心肌細(xì)胞內(nèi)多胺的含量，發(fā)現(xiàn)AMI心衰模型組大鼠的心肌細(xì)胞內(nèi)多胺含量明顯偏高，腐胺、精脒、精胺以及總多胺池水平也明顯增加。與心衰模型組比較，培哚普利組、清熱活血方各濃度組腐胺、精脒及精胺的含量均有不同程度降低，其中高劑量組和中劑量組多胺水平降低明顯，提示清熱活血方有降低VR進(jìn)展中多胺水平的作用。Western blotting法檢測(cè)了心肌組織中ODC、SSAT蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：模型組中ODC和SSAT蛋白的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，而培哚普利組和清熱活血方治療均可以抑制ODC蛋白的表達(dá)，減少多胺的合成，同時(shí)清熱活血方干預(yù)還可以增強(qiáng)SSAT蛋白的表達(dá)，加速多胺進(jìn)一步降解。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們初步得出結(jié)論：清熱活血方可以調(diào)節(jié)心梗后VR過(guò)程中的多胺系統(tǒng)，其抗VR的作用可能是通過(guò)對(duì)多胺及其相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但多胺成分復(fù)雜，每一種胺類在VR中的作用機(jī)制和表達(dá)情況又不盡相同，如有文獻(xiàn)報(bào)道缺血再灌注損傷時(shí)ODC過(guò)度表達(dá)，腐胺含量增加可減少轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠的梗死面積，具有“雙刃劍”作用［17］。 因此，清熱活血方通過(guò)多胺系統(tǒng)對(duì)心梗后VR的改善作用還需要進(jìn)一步的細(xì)化研究。