瀉肺定喘湯對中性粒細胞型哮喘大鼠KLF-2/RelA比例平衡及中性粒細胞凋亡的影響*

韓 瑩 蔡慶宇 張 巖

（1.黑龍江中醫藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江省佳木斯市中醫院，黑龍江 佳木斯 154002；3.佳木斯大學附屬第二醫院，黑龍江 佳木斯 154002）

支氣管哮喘是一種由多種細胞和細胞組分共同參與的，以可變性呼氣氣流受限、氣道高反應和氣道重塑為特征的呼吸道炎癥性疾病［1］。根據最新的一項調查顯示，哮喘的總發病率為6.79%，其中以0～15歲及55～64歲的人群發病率最高，分別為13.05%和10.56%，且女性顯著高于男性［2］。而且隨著近年來環境污染的加劇和生活方式的改變，本病的發病率和死亡率呈現逐年增高的趨勢，已成為世界性的公共衛生問題。

2009年全球哮喘防治創議首次提出 “表型”的概念，通過疾病表型的分類，能夠更好地指導哮喘的治療和預后的判斷。過去的研究認為嗜酸性粒細胞（EA）是哮喘氣道炎癥反應的主要原因，但是越來越多的研究發現，超過50%的哮喘是以中性粒細胞浸潤為主［3］。與EA 相比，中性粒細胞型哮喘（NA）的臨床表現及肺功能更差，急性發作的次數更多，而且缺乏有效的治療措施［4］。因此，本研究通過采用瀉肺定喘湯進行干預NA模型，并觀察KLF-2/RelA比例的平衡及中性粒細胞的凋亡，以明確瀉肺定喘湯的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 48只6周齡雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量（213±12）g，購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心［動物合格證批號：SCXK（黑）2015-003］。 購入后置于黑龍江中醫藥大學佳木斯學院實驗中心飼養，飼養條件2級，溫度18～27℃，相對濕度45%～75%，自由飲水，常規喂養。

1.2 藥劑和儀器 瀉肺定喘湯由白果15 g，麻黃10 g，桑白皮 10 g，地骨皮 10 g，款冬花 10 g，黃芩 10 g，紫蘇子10 g，法半夏5 g，杏仁5 g，炙甘草5 g組成，購于佳木斯市中醫院中草藥局。藥物置于冷水中浸泡2 h后煎煮至生藥質量濃度為低（0.5 g/mL）、中（1 g/mL）和高（2 g/mL）的藥汁。 脂多糖（LPS）、10%卵白蛋白（OVA）、Percoll分離液均購于美國Sigma公司；臺盼藍染色試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；瑞氏染色試劑盒購于上海君瑞生物技術有限公司；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，兔抗大鼠 KLF-2、RelA（p65）、促凋亡基因（Bax）和抑制凋亡基因（Bcl-2）多克隆抗體購于美國Abcam公司；兔抗大鼠β-actin、HRP標記山羊抗兔IgG和超敏ECL化學發光試劑盒購于沈陽萬類生物科技公司；光學顯微鏡購于日本Olympus公司；流式細胞儀購于美國Beckman Coulter公司；超聲霧化器購于上海魚躍醫療設備有限公司；電泳儀、電泳槽和凝膠成像分析系統均購于北京六一生物科技有限公司。

1.3 分組與造模 大鼠隨機分為空白組（Control）、模型組（NA）、地塞米松組（DXN）、瀉肺定喘湯低劑量組（XFD Low）、瀉肺定喘湯中劑量組（XFD Medium）和瀉肺定喘湯高劑量組（XFD High），每組8只。除空白組外，余組大鼠均按照文獻中方法復制NA模型［5-6］，具體方法如下：于實驗開始后的第0天、第7天和第14天腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉后，LPS鼻腔滴入（0.1 μg）和 OVA 腹腔注射（100 μg）聯合致敏，從第 15天開始給予OVA（10 g/L）霧化吸入激發，每日1次，每次30 min，連續2周。空白組大鼠給予生理鹽水替代LPS和OVA致敏和激發。

1.4 給藥方法 各藥物干預組于第15天開始，在每次霧化吸入激發前30 min給予相應的藥物治療。其中地塞米松組給予地塞米松混懸液0.75 mg/kg灌胃，中藥治療藥量參照體表面積法計算［7］，瀉肺定喘湯各劑量組分別給予0.5 g/kg、1 g/kg和2 g/kg的瀉肺定喘湯灌胃治療，而空白組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃治療，上述灌胃治療每日1次，連續2周。

1.5 標本采集與檢測 1）肺泡灌洗液的采集：于末次霧化激發24 h后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，用磷酸緩沖溶液（PBS）灌洗肺泡，按照文獻中方法［8］收集支氣管肺泡灌洗液，1 500 r/min離心后，回收離心后的細胞沉淀，加入紅細胞裂解液，1 500 r/min離心，棄上清液，用于檢測。中性粒細胞的分離純化：采用密度梯度離心法分離制備中性粒細胞。于腹主動脈取血5 mL，加入裝有Percoll分離液的離心管中，400 g離心30 min，取中性粒細胞富集層，0.01 mol/L的PBS洗1遍，低滲法去除紅細胞，PBS重復洗1遍后加入PBS 4 mL懸浮成5×103個/mL，分別采用臺盼藍染色和瑞氏染色檢查細胞活力和純度后立即使用。肺泡灌洗液中細胞計數和分類：取離心后的肺泡灌洗液沉淀，用1 mL PBS重懸細胞，于細胞計數板上進行細胞計數。同時，取20 μL的細胞懸液涂片，固定于染色架上，經瑞氏染色后于光學顯微鏡下做細胞分類計數。2）流式細胞術檢測中性粒細胞的凋亡：將分離純化的中性粒細胞用200 μL Binding Buffer重懸，調整細胞濃度為1×106個/mL， 每個樣本約為 100 μL， 加入 5 μL An nexin V和10 μL的PI溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS重懸，流式細胞儀檢測中性粒細胞的凋亡率。3）蛋白質印跡法檢測中性粒細胞中KLF-2、RelA、Bax和Bcl-2蛋白的表達：采用RIPA裂解液進行總蛋白提取，測定蛋白濃度；加入10%SDSPAGE蛋白上樣緩沖液進行蛋白分離，電泳，轉膜；脫脂牛奶封閉 2 h，加入 KLF2（1∶1 500）、RelA（1∶1 500）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）和 β-actin（1∶500）一抗于4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌后加入HRP標記的二抗，TBST緩沖液洗滌兩次，加入超敏ECL化學發光劑顯影，凝膠圖像分析系統分析各蛋白條帶灰度值，并以 β-actin為內參，計算 KLF-2、RelA、Bax和 Bcl-2蛋白的相對表達值。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間的數據采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組肺泡灌洗液中白細胞計數和分類的比較見表1。造模后，肺泡灌洗液中白細胞數量顯著增加，中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞的百分比均顯著升高，與空白組比較，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）；藥物干預后，地塞米松和瀉肺定喘湯中、高劑量組大鼠肺泡灌洗液中白細胞數量顯著減少，中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞的百分比均顯著降低，與模型組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.01），其中以瀉肺定喘湯高劑量組療效最佳。

表1 各組肺泡灌洗液中細胞計數和分類的比較（x±s）

表1 各組肺泡灌洗液中細胞計數和分類的比較（x±s）

與空白比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組 別 n空白組 8模型組 8地塞米松組 8嗜酸性粒細胞（%） 淋巴細胞（%）0.80±0.10 0.63±0.05 1.43±0.18** 1.11±0.06**1.02±0.08△△ 0.90±0.08△△瀉肺定喘湯低劑量組 8 33.84±10.97 34.12±9.35 1.42±0.18 0.95±0.09△△瀉肺定喘湯中劑量組 8 19.25±7.19△△ 26.20±10.24△△ 1.15±0.13△△ 0.90±0.09△△瀉肺定喘湯高劑量組 8 9.44±2.63△△ 18.20±6.69△△ 0.87±0.06△△ 0.70±0.04△△白細胞計數（105/mL） 中性粒細胞（%）7.61±1.27 10.23±2.87 36.75±9.79** 36.60±4.59**15.42±3.97△△ 20.72±4.95△△

2.2 各組中性粒細胞凋亡率的比較 見表2。造模后，模型組大鼠中性粒細胞的凋亡率顯著降低，與空白組比較，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）；地塞米松和瀉肺定喘湯中、高劑量組均能顯著增加哮喘大鼠中性粒細胞的凋亡，與模型組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。

表2 各組中性粒細胞凋亡率比較（x±s）

表2 各組中性粒細胞凋亡率比較（x±s）

組 別 n 細胞凋亡率（%）空白組 8 7.15±1.12模型組 8 4.07±1.01**地塞米松組 8 8.83±3.13△△瀉肺定喘湯低劑量組 8 5.48±1.44瀉肺定喘湯中劑量組 8 7.88±1.09△△瀉肺定喘湯高劑量組 8 12.05±3.91△△

2.3 各組中性粒細胞中KLF-2、RelA、Bax和Bcl-2蛋白表達的比較 見表3～表4，圖1～圖2。造模后，模型組大鼠中性粒細胞中KLF2、RelA蛋白的表達及KLF-2/RelA的比值顯著降低，與空白組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.01）；地塞米松和瀉肺定喘湯中、高劑量組均能顯著增加中性粒細胞中KLF2、RelA蛋白的表達及上調KLF-2/RelA的比值，與模型組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。造模后，模型組大鼠中性粒細胞中Bax蛋白的表達及Bax/Bcl-2的比值顯著降低，Bcl-2蛋白的表達顯著升高，與空白組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.01）；地塞米松和瀉肺定喘湯中、高劑量組均能顯著增加中性粒細胞中Bax蛋白的表達及上調Bax/Bcl-2的比值，降低Bcl-2蛋白的表達，與模型組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組中性粒細胞中KLF2和RelA蛋白表達的比較（x±s）

表3 各組中性粒細胞中KLF2和RelA蛋白表達的比較（x±s）

組 別 n空白組 8模型組 8地塞米松組 8 KLF2/RelA 2.66±0.72 1.24±0.28**3.00±0.56△△瀉肺定喘湯低劑量組 8 0.19±0.06 0.13±0.02 1.57±0.76瀉肺定喘湯中劑量組 8 0.34±0.04△△ 0.17±0.02△△ 2.03±0.33△△瀉肺定喘湯高劑量組 8 0.59±0.06△△ 0.19±0.05△△ 3.31±1.04△△KLF2/β-actin RelA/β-actin 0.60±0.16 0.23±0.04 0.12±0.01** 0.10±0.02**0.44±0.04△△ 0.15±0.02△△

圖1 各組中性粒細胞中KLF2和RelA蛋白的表達

表4 各組中性粒細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達的比較（x±s）

表4 各組中性粒細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達的比較（x±s）

組 別 n空白組 8模型組 8地塞米松組 8 Bax/Bcl-2 3.39±1.24 0.40±0.08**1.14±0.21△△瀉肺定喘湯低劑量組 8 0.42±0.04 0.68±0.05 0.62±0.09瀉肺定喘湯中劑量組 8 0.45±0.07△△ 0.51±0.07△△ 0.90±0.18△瀉肺定喘湯高劑量組 8 0.64±0.08△△ 0.36±0.08△△ 1.91±0.56△△Bax/β-actin Bcl-2/β-actin 0.70±0.08 0.22±0.05 0.31±0.05** 0.79±0.11**0.57±0.07△△ 0.51±0.05△△

圖2 各組中性粒細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達

3 結 論

NA作為哮喘的一個獨立亞型，是導致患者病情控制不佳、激素治療反應差的重要原因之一［9］。近年來的研究證實，該病與環境污染、吸煙、肥胖、衰老、急慢性呼吸道感染和大劑量糖皮質激素的應用等有關，并且參與小氣道和小血管重構，已成為當前學術界研究的熱點［10］。有研究顯示，中性粒細胞過量的聚集，與氣道中性粒細胞清除受損、凋亡延遲及相關趨化因子的增加有關［11］。活化的中性粒細胞能夠分泌炎性因子（如INF-γ、IL-6及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等），同時升高的趨化因子（如白三烯B4及TNF-α等）還能夠促進中性粒細胞由循環系統進入肺組織中，加重炎癥反應［12］。

KLF-2是鋅指Krüppel樣轉錄調節因子家族成員之一，因其最初發現在肺內高度表達，所以命名為肺Krüppel樣轉錄調節因子［13-14］。 近年來的研究發現，KLF-2能夠通過抑制轉錄因子活化蛋白-1和核因子-κB（NF-κB）等信號通路的活化，從而抑制促炎因子的表達、炎癥細胞和內皮細胞的活化及炎癥細胞的黏附，從而發揮抗炎的作用［15］。 RelA（p65）是 NF-κB 家族成員之一，作為關鍵的抗凋亡信號和二聚體狀態下NF-κB最重要的功能亞基，RelA在中性粒細胞的凋亡中發揮著重要的作用，而KLF-2/RelA的比例失衡能夠調控哮喘患者中性粒細胞的凋亡，并且隨著病情的加重，KLF-2/RelA 比值逐漸降低［16］。Bax 和 Bcl-2 是目前Bcl-2家族研究較多的凋亡調控基因，其中Bcl-2能夠通過阻斷凋亡途徑，抑制細胞凋亡信號的傳導，延長細胞的存活［17］。而Bax作為分子量為21 kDa的蛋白，能夠拮抗Bcl-2蛋白抑制細胞凋亡，從而起到促進細胞凋亡的作用。因此，調控Bax/Bcl-2之間的平衡在調節細胞凋亡的過程中發揮著重要的作用［18］。

哮喘屬于中醫學“哮證”的范疇，早在《黃帝內經》中就有關于本病的描述，并稱其為“喘鳴”“喘喝”。本病病機以本虛標實為主，其中邪實以痰為宿根，本虛則以肺脾腎臟虧虛為本。因此對于本病急性期，首當以祛邪為主，瀉肺定喘湯為筆者所在醫院治療哮喘的經驗方，方由定喘湯合瀉白散化裁而來，方中麻黃宣肺平喘，白果斂肺祛痰，兩者一散一收，既能加強平喘的功效，又能防止麻黃耗傷肺氣。杏仁、紫蘇子、款冬花、法半夏降氣化痰、止咳平喘，在本方中共為臣藥。桑白皮、地骨皮、黃芩清肺泄熱，止咳平喘，為佐藥。炙甘草補脾和胃、調和諸藥，為使。全方共奏宣降肺氣、清熱化痰、止咳平喘的功效。

本研究結果顯示，瀉肺定喘湯能夠顯著抑制模型大鼠肺泡灌洗液中白細胞的數量，降低中性粒細胞的比例，增加中性粒細胞的凋亡。另一方面，瀉肺定喘湯能夠顯著增加中性粒細胞中KLF2、RelA和Bax蛋白的表達，降低Bcl-2蛋白的表達，上調KLF-2/RelA和Bax/Bcl-2的比值，與模型組比較差異均具有顯著統計學意義，而且瀉肺定喘湯的療效亦呈現一定程度的劑量依賴性。

綜上所述，瀉肺定喘湯能夠降低肺泡灌洗液中白細胞的數量和中性粒細胞的比例，因此我們推斷其作用機制可能是通過調控KLF2/RelA的平衡實現的。