分光光度法同時(shí)測(cè)定油脂中氫過(guò)氧化物和醛含量

向思敏，朱振中，王巍巍

(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

油脂在光、熱、金屬催化劑、微生物和水的影響下會(huì)發(fā)生氧化或水解，形成脂質(zhì)氫過(guò)氧化物(初級(jí)氧化產(chǎn)物)。脂質(zhì)氫過(guò)氧化物在高溫或者金屬存在時(shí)易分解形成醛、酮、酸、酯、醇和短鏈烴等次級(jí)氧化產(chǎn)物[1]。目前檢測(cè)油脂初級(jí)氧化產(chǎn)物的方法有比色法[2]、化學(xué)發(fā)光法[3]、FTIR法[4-5]和電化學(xué)方法[6-7]等。其中比色法常用的有亞鐵二甲酚橙法[2]、五磺基水楊酸法[8]和硫氰化鐵法[9]，此類方法均是利用氫過(guò)氧化物的氧化性；化學(xué)發(fā)光法主要是基于堿性魯米諾與氫過(guò)氧化物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；FTIR 則是利用特征性光譜進(jìn)行定性或定量分析；電化學(xué)方法中用得較多的是測(cè)電導(dǎo)率和阻抗。檢測(cè)次級(jí)氧化產(chǎn)物的方法有液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10]和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[11]，常用的衍生化試劑有2,4-二硝基苯肼和2-硫代巴比妥酸，均是利用羰基化合物與胺類的親核加成反應(yīng)。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)評(píng)價(jià)油脂氧化穩(wěn)定性的方法主要是基于測(cè)定油脂的初級(jí)氧化產(chǎn)物(如氫過(guò)氧化物)或者次級(jí)氧化產(chǎn)物(如羰基類化合物)，僅評(píng)價(jià)一種氧化產(chǎn)物使評(píng)價(jià)的可靠性或準(zhǔn)確性難以保證。而分別測(cè)定油脂的初級(jí)氧化產(chǎn)物或次級(jí)氧化產(chǎn)物，將使分析評(píng)價(jià)過(guò)程較為煩瑣費(fèi)時(shí)和不經(jīng)濟(jì)。若能同時(shí)測(cè)定油脂的初級(jí)氧化產(chǎn)物和次級(jí)氧化產(chǎn)物，將使油脂氧化穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)結(jié)果更為可靠和準(zhǔn)確。但有關(guān)同時(shí)測(cè)定油脂的初級(jí)氧化產(chǎn)物和次級(jí)氧化產(chǎn)物的研究鮮見報(bào)道。本文以N，N-二甲基對(duì)苯二胺為顯色劑，利用胺的還原性和親核性分別與氫過(guò)氧化物和羰基反應(yīng)，以達(dá)到同時(shí)測(cè)定油脂氧化過(guò)程中氫過(guò)氧化物和醛的目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

鱷梨油由上海家化聯(lián)合股份有限公司提供，大豆油購(gòu)于超市。N，N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽、乙酸、氯化鋁、鹽酸、無(wú)水乙醇、過(guò)氧化氫(30%)、三氯甲烷、甲醇、還原鐵粉、無(wú)水氯化亞鐵、硫氰酸鉀、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、硫代巴比妥酸、三氯乙酸和乙二胺四乙酸二鈉，均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗儀，數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，雙光束紫外可見分光光度計(jì)，721分光光度計(jì)，DHG-9033B5-Ⅲ鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

配制7.6 mmol/L N,N-二甲基對(duì)苯二胺乙醇溶液，8 mmol/L過(guò)氧化氫乙醇溶液，3.8 mmol/L丙二醛(MDA)溶液。

配制過(guò)氧化氫和丙二醛混合溶液：含0.67 mmol/L的過(guò)氧化氫和0.76 mmol/L的丙二醛。

1.2.2 過(guò)氧化氫和丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取不同體積的過(guò)氧化氫乙醇溶液于5 mL比色管中，加入1 mL 2.74 mmol/L的乙酸溶液和2 mL 7.6 mmol/L N,N-二甲基對(duì)苯二胺乙醇溶液，用乙醇定容至5 mL，配制成0.08、0.12、0.20、0.40、0.67、1.00、1.33、2.00 mmol/L的過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，40℃加熱40 min后，以未加過(guò)氧化氫的溶液為參比，在340～410 nm處測(cè)定吸光度，在最大吸收波長(zhǎng)處繪制過(guò)氧化氫溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

同樣的方法配制0.15、0.23、0.38、0.76、1.26、1.89、2.53 mmol/L的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，40℃加熱40 min，以未加丙二醛的溶液為參比，在340～410 nm處測(cè)定吸光度，在最大吸收波長(zhǎng)處繪制丙二醛溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 油脂中的氫過(guò)氧化物和醛含量的測(cè)定

取適量油脂于120℃烘箱中加熱不同時(shí)間后取0.05 mL置于5 mL比色管中，用乙醇溶解，加入1 mL 2.74 mmol/L乙酸，2 mL 7.6 mmol/L N,N-二甲基對(duì)苯二胺乙醇溶液，用乙醇定容至5 mL，40℃加熱40 min，分別在350 nm和408 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求油脂中氫過(guò)氧化物和醛的含量。

同時(shí)參考GB/T 5009.37—2003中的植物油過(guò)氧化值的測(cè)定方法和GB/T 5009.181—2003中丙二醛的測(cè)定方法，測(cè)定油脂中的氫過(guò)氧化物和丙二醛的含量。

1.2.4 雙變量校準(zhǔn)方法(Kaiser法)[12]

分光光度法測(cè)定選定波長(zhǎng)(λi)下分析物A的線性校正回歸函數(shù)為：

AAi=mAi·CA+eAi

(1)

式中：AAi為波長(zhǎng)λi處的吸光度；mAi為線性回歸的斜率；CA為分析物A的濃度；eAi為截距。

如果二元混合物(A，B)的測(cè)定是在兩個(gè)選定波長(zhǎng)(λ1和λ2)下進(jìn)行的，則：

AAB1=mA1·CA+mB1·CB+eAB1

(2)

AAB2=mA2·CA+mB2·CB+eAB2

(3)

式中：AAB1為混合物A、B在波長(zhǎng)λ1處的吸光度之和；AAB2為混合物A、B在波長(zhǎng)λ2處的吸光度之和；eAB1和eAB2分別為λ1和λ2處線性校準(zhǔn)的截距之和(eABi=eAi+eBi)。

聯(lián)立式(2)和式(3)，求得CA和CB的值：

CA=(AAB1-eAB1-mB1CB)/mA1

(4)

CB=[mA2(AAB1-eAB1)+mA1(eAB2-AAB2)]/(mA2mB1-mA1mB2)

(5)

為獲得測(cè)定混合物(A,B)的最佳波長(zhǎng)，用 Kaiser 法在兩個(gè)選定波長(zhǎng)下測(cè)定混合物的吸光度來(lái)解析二元混合物，并使用線性回歸函數(shù)的參數(shù)在相同波長(zhǎng)處評(píng)估每個(gè)組分，對(duì)每個(gè)二元混合物和每對(duì)預(yù)選波長(zhǎng)創(chuàng)建一系列靈敏度矩陣K：

(6)

式中：mA1、mA2為組分A在選定波長(zhǎng)(λ1，λ2)處的靈敏度參數(shù)的斜率；mB1、mB2為組分B在選定波長(zhǎng)(λ1，λ2)處的靈敏度參數(shù)的斜率。計(jì)算此系列矩陣的分辨率，選擇具有最高絕對(duì)矩陣行列式值的波長(zhǎng)集為測(cè)定混合物(A,B)的最佳波長(zhǎng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外吸收光譜

分別將0.67 mmol/L的過(guò)氧化氫(H2O2)、0.76 mmol/L的丙二醛(MDA)及二者的混合物，以1 mL 2.74 mmol/L乙酸作催化劑，在40℃下與顯色劑反應(yīng)40 min，得到的紫外吸收光譜圖如圖1所示。

圖1 MDA、H2O2、MDA+H2O2的紫外吸收光譜圖

由圖1可以看出，過(guò)氧化氫在348 nm處有較強(qiáng)的吸收，丙二醛在400 nm處有較強(qiáng)的吸收。但混合溶液在348 nm和400 nm處均存在光譜重疊，導(dǎo)致吸收峰不易觀察，難以同時(shí)測(cè)定混合物中的分析物。為此，采用Kaiser方法選擇混合物在這一段波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定最佳波長(zhǎng)。

2.2 最佳波長(zhǎng)的選擇

按1.2.2分別繪制過(guò)氧化氫(348 nm)和丙二醛(400 nm)的吸光度(Y)隨濃度(X)變化曲線。過(guò)氧化氫在0.08～2.00 mmol/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為：Y=0.379 2X-0.000 7，R2=0.999 1，檢出限為0.006 mmol/L。丙二醛在0.15～2.53 mmol/L范圍內(nèi)與吸光度有較好的線性關(guān)系，其線性方程為：Y=0.15X+0.028，R2=0.999 1，檢出限為0.03 mmol/L。

用Kaiser方法在340～410 nm范圍內(nèi)選定11個(gè)波長(zhǎng)，分別由式(1)和式(6)求過(guò)氧化氫和丙二醛的斜率及靈敏度矩陣行列式的絕對(duì)值，結(jié)果見表1和表2。

由表2可知，350 nm和408 nm處的靈敏度矩陣行列式的絕對(duì)值最大，故選擇350 nm和408 nm作為同時(shí)測(cè)定混合溶液中過(guò)氧化物和丙二醛含量的最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

表1 H2O2和MDA的線性回歸校準(zhǔn)的斜率

表2 靈敏度矩陣行列式的絕對(duì)值(K×10-4)

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 催化劑的選擇

取1 mL過(guò)氧化氫和丙二醛混合溶液，加入2 mL 7.6 mmol/L顯色劑、1 mL 2.74 mmol/L不同種類的酸，用乙醇定容至5 mL，40℃反應(yīng)40 min，以未加催化劑的溶液為參比，測(cè)定330～420 nm范圍的吸收峰面積，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同種類的酸催化劑對(duì)反應(yīng)的影響

由圖2可知，濃鹽酸能使顯色的顏色迅速褪去，吸光度無(wú)明顯增大，乙酸和氯化鋁對(duì)吸光度的增加較為明顯。其中，乙酸的效果最好，故選擇乙酸作為催化劑。

2.3.2 顯色劑最佳濃度的選擇

取1 mL過(guò)氧化氫和丙二醛混合溶液，加入1 mL 2.74 mmol/L的乙酸、2 mL不同濃度的顯色劑溶液，用乙醇定容至5 mL，以未加顯色劑的溶液為參比，對(duì)混合溶液在40℃下加熱40 min，在350 nm和408 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖3。

圖3 吸光度隨顯色劑濃度的變化

從圖3可以看出，350 nm和408 nm處的吸光度均隨顯色劑濃度的增加而增大。當(dāng)顯色劑濃度高于7.6 mmol/L后，吸光度的增加趨緩。故選擇顯色劑的濃度為7.6 mmol/L。

2.3.3 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的影響

取1 mL過(guò)氧化氫和丙二醛混合溶液，加入1 mL 2.74 mmol/L的乙酸、2 mL 7.6 mmol/L的顯色劑溶液，用乙醇定容至5 mL，分別在30、40、50℃下加熱不同時(shí)間，以不含混合液的溶液作參比，在350 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖4。

圖4 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響

由圖4可知，隨反應(yīng)溫度的升高，吸光度達(dá)最大值所需的時(shí)間越短，30℃為50 min，40℃為40 min，50℃為30 min。但反應(yīng)溫度越高，吸光度達(dá)到最高后經(jīng)一段時(shí)間后會(huì)緩慢降低。故選擇40℃反應(yīng)40 min作為本方法的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。

2.4 油脂中氫過(guò)氧化物和丙二醛的同時(shí)測(cè)定

以350 nm和408 nm為混合溶液的測(cè)定波長(zhǎng)，結(jié)合式(1)分別得出混合溶液中過(guò)氧化氫和丙二醛在不同波長(zhǎng)處的線性回歸方程，結(jié)果見表3。

表3 混合溶液中過(guò)氧化氫和丙二醛的

根據(jù)表3中回歸方程的相關(guān)參數(shù)及在350 nm和408 nm處分別測(cè)定的混合液的吸光度，由式(4)和式(5)即可求出氫過(guò)氧化物和醛的濃度。

按1.2.3分別測(cè)定大豆油和鱷梨油在120℃加熱不同時(shí)間的氫過(guò)氧化物和丙二醛的含量，同時(shí)按國(guó)標(biāo)法測(cè)定二者的含量，結(jié)果見表4。在置信度為95%下，計(jì)算F值和t值，比較兩種方法的顯著性，結(jié)果見表5。

表4 大豆油和鱷梨油的氫過(guò)氧化物含量和丙二醛含量

表5 方法的顯著性檢驗(yàn)

由表4可知，大豆油和鱷梨油的氫過(guò)氧化物含量和丙二醛含量均隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，且鱷梨油的氫過(guò)氧化物含量和丙二醛含量的變化較大豆油的大，說(shuō)明鱷梨油較大豆油更易氧化。從表4還可得出，丙二醛含量的增速較氫過(guò)氧化物緩，且丙二醛含量遠(yuǎn)小于氫過(guò)氧化物含量，可能是由于丙二醛是次級(jí)氧化產(chǎn)物再降解而形成的低相對(duì)分子質(zhì)量的產(chǎn)物。此外，國(guó)標(biāo)法所測(cè)的氫過(guò)氧化含量值與本方法的測(cè)定結(jié)果相近，而國(guó)標(biāo)法所測(cè)的丙二醛含量均比本方法的測(cè)定值略小，可能是由于油脂氧化過(guò)程中除丙二醛外其他的單鏈醛也有吸收而引起。

由表5可知，在置信度為95%時(shí)，大豆油、鱷梨油的F值和t值均小于F(0.05,3)和t(0.10,3)，說(shuō)明兩種測(cè)定方法之間不存在顯著性差異。

3 結(jié) 論

本文建立了一種分光光度法同時(shí)測(cè)定油脂中氫過(guò)氧化物和醛含量方法，所測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法對(duì)比均無(wú)顯著性差異。由于該方法能同時(shí)測(cè)定油脂的初級(jí)氧化產(chǎn)物和次級(jí)氧化產(chǎn)物，可為評(píng)價(jià)油脂氧化穩(wěn)定性提供更為可靠和準(zhǔn)確的參數(shù)，也可為構(gòu)建預(yù)測(cè)油脂貨架期模型提供新的思路。