超聲波輔助水酶法提取柚子籽油及其抗氧化性研究

葉 茂,鄧毛程,嚴立遜,黃 瑩,劉如運

(1.廣東輕工職業技術學院 食品與生物技術學院, 廣州 510300; 2.廣東輕工職業技術學院 廣東省特色調味品工程技術開發中心, 廣州 510300)

柚子(CitrusgrandisOsbecko)是蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)植物，在我國長江以南各省廣泛種植，且單產和產量逐年增加。柚子皮和果實已經被廣泛用于食品、化妝品、醫藥行業，如用果肉加工飲料，從柚子皮中提取色素、精油、果膠等[1-2]，但柚子加工的副產品柚子籽卻未得到合理利用。柚子籽較其他柑橘類籽大，質量為柚子整果肉質量的0.1%～4.0%。柚子籽含有粗脂肪、蛋白質、膳食纖維、黃酮類化合物、檸檬苦素類似物、礦物元素、維生素等多種化學成分，其油脂含量豐富，一般在40%以上，富含亞油酸、油酸等，有較高的實用價值，可以作為新的油脂資源[3-4]。

目前，關于柚子籽油的提取方法主要有超聲波輔助提取法[5]、有機溶劑萃取法[6]。水酶法提油工藝條件溫和，能夠很好地保護油脂中營養物質，迄今國內外研究水酶法提油工藝研究涉及芝麻、油菜籽、油茶籽、紅花籽等多種油料作物[7-9]。為此，本文采用超聲波輔助水酶法提取柚子籽油，對酶解條件進行優化，確定柚子籽油提取的最優工藝參數，并比較維生素C、白藜蘆醇與柚子籽油的抗氧化性，以期為柚子籽油的綜合開發利用提供一條新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

柚子籽，購自超市；纖維素酶(5 000 U/g)、中性蛋白酶(10 000 U/g)，購自廣州大久生物科技有限公司；維生素C(分析純)，購自廣州化學試劑廠；白藜蘆醇，購自北京諾其雅盛生物科技有限公司。

FW135型中草藥粉碎機，HH-4數顯恒溫水浴鍋，KQ-250DB型數控超聲波破碎儀，LD5-2A型離心機，SP-756P紫外-可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 柚子籽油的提取

將柚子籽恒溫干燥后，粉碎。稱取5.0 g柚子籽粉置于三角瓶中，加入40 mL蒸餾水，置于超聲波破碎儀中進行預處理(130 W，15 min，45℃)，然后取出調節pH，加入復合酶制劑(纖維素酶和中性蛋白酶)，在一定溫度下酶解一定時間。酶解結束后，在沸水浴中滅酶10 min，離心(12 000 r/min，15 min)，收集上層游離的油，稱量，按下式計算柚子籽油得率。

1.2.2 羥自由基清除率的測定

采用胡翠珍等[10]的方法并改進。將1.8 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1.8 mmol/L過氧化氫溶液、1.8 mmol/L 70%的水楊酸-無水乙醇溶液(1.8 mmol/L水楊酸-無水乙醇和1.8 mmol/L水楊酸溶液按1∶3混合)、一定質量濃度的試樣按順序加入到試管中，振蕩反應10 min，以蒸餾水為參比，于510 nm處測定吸光度，按下式計算羥自由基清除率。

式中：A0為2 mL硫酸亞鐵+2 mL水楊酸-無水乙醇溶液+5 mL蒸餾水+2 mL過氧化氫吸光度；Ai為2 mL硫酸亞鐵+2 mL水楊酸-無水乙醇溶液+5 mL樣品液+2 mL過氧化氫吸光度；Aj為2 mL硫酸亞鐵+2 mL蒸餾水+5 mL樣品液+2 mL過氧化氫吸光度。

1.2.3 超氧陰離子自由基清除率的測定

采用程德竹等[11]的方法并改進。取0.05 mol/L pH 9.0的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，置于25℃水浴中預熱20 min，分別加入1 mL試樣和0.4 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應5 min，加入2.0 mL 2 mol/L HCl溶液終止反應，以Tris-HCl緩沖液作參比，在320 nm處測定吸光度A1，以等體積的蒸餾水代替試樣，測定吸光度A0，按下式計算超氧陰離子自由基清除率。

1.2.4 數據處理

實驗數據用SPSS20.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 酶添加量對柚子籽油得率的影響

在pH 7、酶解溫度40℃、纖維素酶與中性蛋白酶比例1∶1、酶解時間30 min條件下，考察不同酶添加量對柚子籽油得率的影響，結果見圖1。

圖1 酶添加量對柚子籽油得率的影響

植物細胞壁是以纖維素為骨架，并與半纖維素、果膠及蛋白質等大分子結合而成。纖維素酶可有效降解植物細胞壁的纖維素骨架，蛋白酶可對細胞膜上的脂蛋白進行水解使其中油脂得以釋放，還可對酶解過程中形成的、包裹在油滴外的蛋白膜進行降解，使油脂游離。從圖1可以看出，當酶添加量為0.2%～2.0%(以柚子籽質量計，下同)時，柚子籽油得率隨酶添加量提高逐漸增加，當酶添加量超過2.0%后，柚子籽油得率增加不明顯，這與酶添加量對許多油脂得率的作用結果基本一致[12-13]。考慮到工業化生產成本，酶添加量選擇2.0%。

2.2 pH對柚子籽油得率的影響

在酶添加量2.0%、酶解溫度40℃、纖維素酶與中性蛋白酶比例1∶1、酶解時間30 min條件下，考察不同pH對柚子籽油得率的影響，結果見圖2。

從圖2可以看出，當pH為6時，柚子籽油得率達到最大值，為22.7%，在pH大于6時，柚子籽油得率下降，這可能與復合酶制劑的最適pH有關。故選定提取柚子籽油的最適pH為6。

圖2 pH對柚子籽油得率的影響

2.3 酶解溫度對柚子籽油得率的影響

在酶添加量2.0%、pH 6、纖維素酶與中性蛋白酶比例1∶1、酶解時間30 min條件下，考察不同酶解溫度對柚子籽油得率的影響，結果見圖3。

圖3 酶解溫度對柚子籽油得率的影響

從圖3可以看出，當酶解溫度為50℃時，柚子籽油的得率最高，達到26.6%。因此，酶解溫度選擇50℃。

2.4 纖維素酶與中性蛋白酶比例對柚子籽油得率的影響

在酶添加量2.0%、pH 6、酶解溫度50℃、酶解時間30 min條件下，考察不同纖維素酶與中性蛋白酶比例對柚子籽油得率的影響，結果見圖4。

圖4 纖維素酶與中性蛋白酶比例對柚子籽油得率的影響

纖維素酶可有效降解植物細胞壁的纖維素骨架，蛋白酶可對細胞膜上的脂蛋白進行水解使其中油脂得以釋放，纖維素酶與蛋白酶的比例可直接影響油的得率[14]。從圖4可以看出，當纖維素酶與中性蛋白酶比例為2∶1時，柚子籽油得率最高，為28.6%。故選擇纖維酶與中性蛋白酶比例為2∶1。

2.5 酶解時間對柚子籽油得率的影響

在酶添加量2.0%、pH 6、酶解溫度50℃、纖維素酶與中性蛋白酶比例2∶1條件下，考察不同酶解時間對柚子籽油得率的影響，結果見圖5。

圖5 酶解時間對柚子籽油得率的影響

從圖5可以看出，在15～60 min范圍內，隨著酶解時間延長柚子籽油得率不斷增加，在酶解時間60 min時柚子籽油得率達到33.2%，但酶解時間超過60 min以后，柚子籽油得率基本不變。這說明酶解反應達到一定時間后，由于原料減少，得率趨于恒定，所以酶解時間選擇60 min。

2.6 柚子籽油的抗氧化性

2.6.1 對羥自由基的清除作用(見圖6)

圖6 不同物質對羥自由基清除作用的比較

由圖6可知，在低質量濃度20～40 μg/mL時，柚子籽油的羥自由基清除率低于維生素C和白藜蘆醇，當質量濃度達到80～100 μg/mL時，柚子籽油與維生素C和白藜蘆醇的羥自由基清除率基本一致；當質量濃度達到120 μg/mL及以上時，其羥自由基清除率顯著高于維生素C和白藜蘆醇。

2.6.2 對超氧陰離子自由基的清除作用(見圖7)

圖7 不同物質對超氧陰離子自由基清除作用的比較

從圖7可以看出，柚子籽油與相同質量濃度的維生素C和白藜蘆醇對超氧陰離子自由基的清除作用無顯著差異。由此可見，柚子籽油與常見的抗氧化劑一樣對超氧陰離子自由基具有較強的清除作用。推測柚子籽油含有較多的類黃酮、檸檬苦素等有效抗氧化成分。

3 結 論

以超聲波輔助水酶法提取柚子籽油最佳工藝條件為：酶添加量2.0%，pH 6.0，酶解溫度50℃，纖維素酶與中性蛋白酶比例2∶1，酶解時間60 min。在最佳工藝條件下，柚子籽油得率達到33.2%。

柚子籽油質量濃度為120 μg/mL及以上時，對羥自由基的清除能力高于維生素C和白藜蘆醇，柚子籽油對超氧陰離子自由基的清除能力等同于相同質量濃度(1～10 mg/mL)的維生素C和白藜蘆醇。因此，柚子籽油具有良好的抗氧化能力。