響應面優化超聲-酶輔助強化油橄欖葉多糖的提取

原姣姣，陳錦璇，張 帆，涂軍令，秦貫豐，李 冰

(1.東莞理工學院 化學工程與能源技術學院，廣東 東莞 523808； 2.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640)

油橄欖(OleaeuropaeaL.)，屬木犀科木犀欖屬常綠喬木，是世界著名的木本油料樹種之一[1]。橄欖油由成熟的油橄欖鮮果直接冷榨而成，較大限度地保留了其原有的營養價值，具有抗衰老、預防心腦血管疾病、抗腫瘤、促進骨骼和神經系統發育等多種功能[2-3]。由于對油橄欖葉有效成分的認知缺乏，油橄欖葉被丟棄、埋藏或焚燒，造成資源浪費和環境負擔。事實上，油橄欖葉富含多種活性成分，如橄欖苦苷[4]、羥基酪醇[5]等多酚、黃酮和多糖等。研究發現植物多糖具有抗腫瘤[6-7]、降血脂[8]、抗氧化、抗疲勞[9]等作用。

目前，植物多糖的提取方法有熱水浸提法、堿浸提法、酶解法、微波提取法、超聲提取法。傳統提取方法因簡單安全在工業上被廣泛應用，但耗時較長，效率低。超聲提取能夠破壞細胞壁，增加溶劑穿透力，高效快速提取細胞內物質，提高了傳質速率，對提取物的結構和活性不產生影響，從而提高提取率和縮短提取時間[10-12]。為此，本文利用超聲物理場和酶解相結合，探討油橄欖葉多糖的提取以及深加工新的手段和方法，旨在為植物資源在食品、醫藥領域的高值化利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

油橄欖葉，購于甘肅隴南市武都種植區，篩選出無任何機械損傷、病蟲害的新鮮油橄欖葉，對其進行清洗，真空干燥后粉碎，過40目篩，制備成粒度大小均勻的油橄欖葉粉末。

無水乙醇、石油醚(60～90℃)、苯酚、濃硫酸、葡萄糖，均為分析純，天津市大茂化學試劑廠；纖維素酶(BIOSHARP?)；果膠酶(BIOSHAR?)。

1.1.2 儀器與設備

723可見分光光度計，ME204E電子天平(梅特勒-托利多公司)，DZF-6090真空干燥箱，RE-52AA旋轉蒸發器，TG20-WSI離心機，JP-040S超聲波清洗機，HH-S4恒溫水浴鍋，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器。

1.2 實驗方法

1.2.1 油橄欖葉多糖的提取

基于多糖成分大多溶于水的特性，本研究采用石油醚和乙醇溶液熱回流預處理油橄欖葉，以去除油橄欖葉中脂溶性成分和醇溶性成分，為油橄欖葉多糖提取提供便捷。具體提取工藝流程為：油橄欖葉粉末→石油醚熱回流(60℃，1 h)→抽濾→70%乙醇熱回流(70℃，1 h)→抽濾→乙醇洗兩次→超聲提取/酶提取→抽濾→浸膏→醇沉過夜→離心干燥→油橄欖葉多糖。

1.2.2 多糖的測定

采用苯酚硫酸法[13]。硫酸可以使多糖水解成單糖，然后與苯酚形成橙黃色物質，使用分光光度計在波長490 nm測定其吸光度。通過葡萄糖標準曲線計算相應的多糖質量濃度。

1.2.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

取8支干凈的試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的葡萄糖溶液，定容至1.5 mL，再加入0.5 mL 6%的苯酚溶液，充分振蕩搖勻后緩慢逐滴加入濃硫酸3.0 mL，搖勻后靜置30 min，以質量濃度為0的葡萄糖溶液作為空白對照進行調零，在最大吸收波長490 nm測定不同質量濃度的葡萄糖溶液的吸光度。以葡萄糖質量濃度(x)為橫坐標，吸光度(y)為縱坐標，利用Origin軟件繪制標準曲線，并用線性擬合求得回歸方程為y=0.07x+0.06，在0～20 μg/mL范圍內有良好的線性關系。

1.2.2.2 待測樣品多糖的測定

將提取的多糖稱取0.01 g，溶解于蒸餾水中，定容到100 mL，取0.5 mL，按1.2.2.1實驗步驟，測出溶液的吸光度并根據回歸方程計算待測溶液的多糖質量濃度。按下式計算多糖提取率[14]。

多糖提取率=cNVf/m×100%

式中：c為多糖質量濃度，g/mL；N為稀釋倍數；V為定容體積，mL；f為校正系數，取值0.9；m為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 酶提取單因素實驗

2.1.1 纖維素酶與果膠酶質量比對油橄欖葉多糖提取率的影響

稱量2 g油橄欖葉干粉，在不同質量比的纖維素酶與果膠酶添加量0.6%、液(水，下同)料比20∶1、酶解溫度30℃、酶解時間2 h條件下進行提取，提取的多糖溶液過濾后，濾液旋轉蒸發至膏狀，然后加入50 mL無水乙醇進行醇沉過夜，離心干燥，計算多糖提取率，結果見圖1。

圖1 纖維素酶與果膠酶質量比對多糖提取率的影響

由圖1可知，纖維素酶對油橄欖葉多糖提取的影響大于果膠酶，在纖維素酶與果膠酶質量比為 2∶1 時油橄欖葉多糖提取率最高，因此最優的纖維素酶與果膠酶質量比選擇2∶1。

2.1.2 酶解溫度對油橄欖葉多糖提取率的影響

稱量2 g油橄欖葉干粉，在纖維素酶與果膠酶質量比2∶1條件下，改變酶解溫度，其他條件及操作同2.1.1，考察酶解溫度對多糖提取率的影響，結果見圖2。

圖2 酶解溫度對多糖提取率的影響

由圖2可知，當酶解溫度在20～50℃時，多糖提取率隨著酶解溫度的升高而增加。當酶解溫度超過50℃后，多糖提取率反而會下降，這是因為溫度較高時酶活性降低，酶促反應減弱，多糖提取率也隨之降低。因此，最佳酶解溫度選擇50℃。

2.1.3 酶解時間對油橄欖葉多糖提取率的影響

稱量2 g油橄欖葉干粉，在酶解溫度30℃條件下，改變酶解時間，其他條件和操作同2.1.2，考察酶解時間對多糖提取率的影響，結果見圖3。

圖3 酶解時間對多糖提取率的影響

由圖3可知，當酶解時間在1～3 h時，多糖提取率隨著酶解時間的延長而增加。當酶解時間超過3 h時，多糖提取率基本不變。因此，從時間效益考慮最佳酶解時間選擇3 h。

2.2 超聲提取單因素實驗

2.2.1 液料比對油橄欖葉多糖提取率的影響

稱量2 g油橄欖葉干粉，在超聲體積功率密度120 W/L、超聲時間30 min條件下，改變液料比，對油橄欖葉多糖進行提取，提取的多糖溶液過濾后，濾液旋轉蒸發至膏狀，然后加入50 mL無水乙醇進行醇沉過夜，離心干燥，分析計算多糖提取率，結果見圖4。

由圖4可知，當液料比在10∶1～30∶1時，多糖提取率隨著液料比的增加而增加。當液料比超過30∶1時，多糖提取率有所下降。因此，從生產效益考慮最佳液料比選擇30∶1。

圖4 液料比對多糖提取率的影響

2.2.2 超聲時間對油橄欖葉多糖提取率的影響

稱量2 g油橄欖葉干粉，在液料比20∶1條件下，改變超聲時間，其他條件及操作同2.2.1，考察超聲時間對多糖提取率的影響，結果見圖5。

圖5 超聲時間對多糖提取率的影響

由圖5可知，當超聲時間在10～20 min時，多糖提取率隨著超聲時間的延長而增加。當超聲時間超過20 min時，多糖提取率隨著超聲時間的延長而減少。因此，從生產效益考慮最佳超聲時間選擇20 min。

2.3 超聲-酶輔助法不同提取順序的影響

根據單因素實驗結果，確定：酶提取油橄欖葉多糖的條件為2 g油橄欖葉干粉、纖維素酶與果膠酶質量比2∶1、酶添加量0.6%、液料比30∶1、酶解溫度50℃、酶解時間3 h；超聲提取油橄欖葉多糖的條件為2 g油橄欖葉干粉、液料比30∶1、超聲體積功率密度120 W/L、超聲時間20 min。考慮到酶解3 h時油橄欖葉多糖提取率達到2.75%左右，超聲20 min時多糖提取率可達3.85%左右，超過20 min多糖提取率會降低，因此選擇超聲-酶輔助法同時進行時提取時間為20 min。超聲-酶輔助法不同提取順序對油橄欖葉多糖提取率的影響見表1。

表1 提取順序對多糖提取率的影響

注：相同小寫字母表示沒有統計學差異(Tukey檢驗，P>0.05)，不同小寫字母表示有差異顯著性(Tukey檢驗，P<0.05)。

由表1可知，先酶解后超聲時多糖提取率最高，這是由于在酶解過程中利用酶的生物降解作用，分解了油橄欖葉的細胞壁結構，結合超聲作用可以加速多糖的溶出。3種提取順序所得的多糖提取率存在顯著性差異(P<0.05)，說明這3種提取方式對多糖的提取率有很大區別。因此，先酶解后超聲的提取方式選擇為最佳工藝。

2.4 超聲-酶輔助法提取油橄欖葉多糖的響應面優化實驗

根據單因素實驗結果，結合各因素對多糖提取率的變化范圍以及拐點波動大小等影響，綜合考慮選取3個因素，即液料比(A)、酶解溫度(B)和超聲時間(C)作為變量，多糖提取率(Y)為響應值進行超聲-酶輔助提取油橄欖葉多糖的響應面設計，并對實驗結果進行統計分析，結果見表2、表3。

表2 響應面設計因素水平

表3 響應面設計及實驗結果

利用Design-Expert軟件擬合表3中的數據，可以得到多糖提取率回歸方程為：Y=4.39+0.11A+0.25B-0.056C+0.035AB+0.020AC-0.017BC-0.046A2-0.34B2-0.18C2。

對回歸方程進行方差分析，結果見表4。

由表4可知，回歸模型P<0.001，證明該回歸模型達到極顯著的水平，模型相關系數R2為0.991 5，表明99.15%以上的實驗數據可以通過該數學模型來解釋，說明回歸方程可靠性較高。失擬項P>0.05，表明失擬項差異不顯著，殘差是由隨機誤差引起的。方差分析結果表明，該模型對油橄欖葉多糖提取率的實際值與預測值有很好的擬合度，可用于分析、預測油橄欖葉多糖的最佳提取工藝條件。另外，3個因素對多糖提取率影響的強弱為:酶解溫度最大，液料比次之，超聲時間最小。一次項A、B、C，二次項B2、C2對實驗結果影響極顯著(P<0.01)；交互項AB、AC、BC，二次項A2對實驗結果影響不顯著(P>0.05)；這說明實驗因素與多糖提取率之間沒有簡單的線性關系，而是非線性關系[15]。

表4 方差分析

模型預測最佳提取工藝條件為:液料比40∶1，酶解溫度54.24℃，超聲時間18.78 min。在最佳提取條件下，油橄欖葉多糖的提取率為4.52%。因為實際操作具有局限性，各因素分別取整，修正為：液料比40∶1，酶解溫度54℃，超聲時間19 min。在最佳提取條件下進行3次驗證實驗，得到油橄欖葉多糖提取率的平均值為4.50%。實驗結果穩定，重現性較好，和模型預測值的誤差僅為0.02個百分點，說明該模型具有有效性。

2.5 油橄欖葉細胞壁微觀結構形貌變化

SEM作為一種有效的工具能夠用來觀察油橄欖葉提取多糖前后樣品表面的形態變化。油橄欖葉原料、水提取多糖后、超聲-酶輔助提取多糖后油橄欖葉的掃描電鏡圖如圖6所示。

由圖6可見，與原料相比，經水提取、超聲-酶輔助提取的樣品微觀結構都發生了明顯變化。油橄欖葉的細胞壁表面整齊，并且細胞壁相鄰孔洞之間排列緊密。水提取后的油橄欖葉細胞壁表面已經有些松散，外形比較粗糙，但結構并未被破壞。經超聲-酶輔助提取后油橄欖葉的細胞壁表面結構破壞嚴重，有大量的孔洞出現，并且相鄰孔洞之間排列疏松。這是因為超聲和酶解相互作用，導致細胞壁結構發生改變。油橄欖葉細胞壁結構的改變有利于細胞內的成分釋放出來，使提取過程中傳質阻力大大減小，提高了傳質速率以及多糖的提取率。Zhang等[16]對比了超聲輔助酶解方法提取銀杏葉前后的細胞結構，同樣發現細胞壁結構發生了很大的改變，提高了提取效率。

圖6 不同樣品的掃描電鏡圖

3 結 論

采用超聲-酶輔助提取油橄欖葉中的多糖，根據單因素實驗結果選取對油橄欖葉多糖提取率影響較大的液料比、酶解溫度、超聲時間3個因素進行響應面設計實驗，并建立了油橄欖葉多糖提取率的二次多項式數學模型，經驗證表明該數學模型具有有效性，可在實際生產中進行預測。實驗確定采用先酶解再超聲的方式提取油橄欖葉多糖的效果比較好，并確定最佳工藝條件為：纖維素酶與果膠酶質量比2∶1，酶添加量0.6%，液料比40∶1，酶解溫度54℃，酶解時間3 h，超聲體積功率密度120 W/L，超聲時間19 min。在最佳條件下，油橄欖葉多糖提取率可達4.50%。經掃描電鏡(SEM)對不同提取方法的樣品微觀結構形態進行觀察，結果說明超聲-酶輔助提取過程使油橄欖葉細胞壁嚴重破壞，這種破壁作用可以使提取過程中傳質阻力大大減小，提高了傳質速率和活性物質多糖的提取率。該研究結果不僅為油橄欖葉多糖的高效提取提供了工藝路線和工藝參數的數據支撐，而且對一般植物多糖的提取具有參考價值。