蚯蚓糞肥輸入促進水稻土有機磷礦化的機制研究

張峰 ，王榮萍*，梁嘉偉，吳永貴，王現潔，廖新榮

1. 貴州大學資源與環境工程學院，貴州 貴陽 550025；2. 廣東省生態環境技術研究所/廣東省農業環境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510650

磷是植物體中除碳、氫、氧、氮外含量最為豐富的元素，其參與植物體內諸多代謝過程（Vance et al.，2003；Lynch，2007）。土壤作為植物磷的主要供給來源，其中的磷素含量和活性與植物的生長發育密切相關，而土壤中能被植物直接吸收利用的磷含量極低且易被礦物質和有機質等固定。據統計，全球耕地約43%缺磷，磷已成為全球農業生產的一大重要限制因子（Su et al.，2015）。施用磷肥是補充土壤有效磷最快、最有效的途徑，然而磷肥當季利用率不高，施入土壤中的磷有80%－93%被蓄積在土壤中而難以被植物利用（閆湘等，2008；趙偉等，2018）。磷肥的低利用率導致農業生產中為追求產量而對其過度投入，不僅造成資源浪費，同時存在抑制土壤微生物活性，土壤養分失調，重金屬和磷蓄積以及土壤酸堿化等潛在危害，嚴重影響土壤各方面能力（Hinsinger，2001；白文娟等，2018）。因此如何在不降低土壤質量前提下提高施入土壤中的磷素利用率，促進土壤磷循環是當今農業生產以及農業污染防治上亟需解決的重要問題。

化肥養分含量高，肥效快，但存在持續作用時間短和營養單一等問題，而有機肥與之相反，其富含有機質，可通過不斷礦化釋放養分，肥效緩慢，但能對植物所需各種養分進行持續補充，同時對土壤理化環境和微生物環境具有明顯改善效果。有機磷作為土壤磷庫重要組成部分，占土壤總磷的20%－80%（劉濤等，2016），土壤有機磷礦化在植物磷營養中占據重要地位，有研究表明，土壤有機磷年礦化率在2%－4%范圍內，數量較少，但在自然條件下可以有效提高土壤速效磷水平（趙少華等，2004）；Dodd et al.（2015）采用 Bowman-Cole有機磷分級研究發現，土壤有效磷與活性有機磷、中活性有機磷以及中穩性有機磷的相關性均顯著，表明有機磷庫礦化可直接對土壤有效磷源進行補充。蔡觀等（2017）的研究更進一步證明自然條件下旱地土壤有機磷礦化是有效磷的主要來源。蚯蚓糞肥是蚯蚓利用土壤有機質所產生的排泄物，區別于普通堆肥產物，其養分全面，且具有優良的物理化學以及生物學性質，近幾年在農業領域被廣泛研究（Bhat et al.，2018；Abdissa et al.，2018；單穎等，2017）。本研究通過盆栽試驗探討分析蚯蚓糞肥添加對小白菜（Brassica chinensisL.）生長和磷素吸收的影響，以及蚯蚓糞肥添加下土壤中各形態有機磷質量濃度和微生物活性的變化，旨在為更合理利用磷肥以及保護有限耕地資源提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試土壤為河流沖擊物母質發育而來的多年耕水稻土，屬壤質粘土，采自廣州市南沙農業科學研究院農業推廣基地（22°43′N，113°33′E）。土壤采集后置于陰涼干燥處自然風干，去除小石塊、動植物殘體后碾碎過3 mm篩，密封保存備用。供試蚯蚓糞肥來自廣東省清遠市佛岡沃土農業科技有限公司（主要原料為禽畜糞便和作物秸稈），使用前對其進行自然風干，研磨后過2 mm篩，密封保存備用，取部分蚯蚓糞肥提取水溶態有機質（DOM）進行分級，經測定其不同分子量（＜14000 Da、14000－3500 Da、＞3500 Da）DOM 質量分數分別為78.76 、410.77、597.75 mg·kg-1。供試土壤和蚯蚓糞肥基本理化性質見表1。

試驗所用無機肥為尿素（N 46.1%）、磷酸二氫鉀（P2O545.9%，K2O 20.4%）和氯化鉀（K2O 60.4%）。供試小白菜為優選上海青（江西省豐城市航城種業有限公司），種子于育苗盤育苗至第 3片真葉長出即開始移栽。

1.2 試驗設計

試驗在溫室大棚內進行，采用單因素隨機區組設計，蚯蚓糞肥設置4個水平，分別為對照（CK，0 g·kg-1）、低量（A1，40 g·kg-1）、中量（A2，80 g·kg-1）、高量（A3，120 g·kg-1），4 次重復。化肥按比例 N∶P2O5∶K2O=1.5∶1.0∶1.5 添加，即尿素 332 mg·kg-1、磷酸二氫鉀 192 mg·kg-1、氯化鉀 182 mg·kg-1。試驗每盆裝土1 kg，化肥和蚯蚓糞與土混合均勻后裝盆，分層壓緊，保持一定土面高度，并且加水調節土壤含水量至田間最大持水量的60%。每盆移栽3棵小白菜，在培養期間每天定時稱重定量補水。在小白菜培養的第0天、7天、14天、21天破壞性采集土壤樣品，在第 35天（收獲期）分別采集根際土、非根際土，測定各項指標。

1.3 主要指標測定方法

DOM采用透析袋法分級，TOC儀測定（Chen et al.，2010）；土壤各形態有機磷按照 Tiessen et al.（2010）對Hedley磷素分級的改進方法連續提取，鉬銻抗比色法測定；微生物生物量C、微生物生物量P采用氯仿熏蒸提取后測定（吳金水，2006）；土壤鹽酸提取態Fe(Ⅱ)用0.5 mol·L-1稀鹽酸提取后鄰菲羅啉比色法測定（Yu et al.，2016）；酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉-4-氨基安替比林比色法測定（Ge et al.，2018）；土壤和蚯蚓糞肥的pH、有機質、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷（Olsen-P）、速效鉀均參照魯如坤（2000）的分析方法測定。

1.4 數據分析

本次試驗數據采用Microsoft Office Excel 2010進行統計，IBM SPSS statistics 20進行數據分析，Oringin 8.5.1作圖。

2 結果與分析

2.1 蚯蚓糞肥對土壤微生物生物量碳、微生物生物量磷的影響

土壤微生物生物量碳變化如圖 1a所示，各組小白菜根際土微生物生物量碳含量均極顯著高于非根際土，收獲期處理組根際土和非根際土微生物生物量碳相比對照組均有明顯增加，其中在根際土中微生物生物量碳含量隨施入的蚯蚓糞肥質量水平提高而上升，而隨著蚯蚓糞肥施入量的繼續增加，其含量趨于穩定，在非根際土中微生物生物量碳含量則隨著蚯蚓糞肥施入量增加而保持緩慢上升。土壤微生物生物量磷變化如圖1b，隨著蚯蚓糞肥施入量的增加，根際土和非根際土微生物生物量磷含量均有所上升，其中以非根際土上升趨勢最為明顯。從根際土和非根際土之間比較來看，對照組小白菜根際土微生物生物量磷含量極顯著高于非根際土，而在處理組中則相反。土壤微生物生物量碳磷比變化由圖 1c可知，蚯蚓糞肥對小白菜根際土和非根際土微生物生物量碳磷比均有降低作用，對照組中根際土微生物生物量碳磷比高于非根際土的0.3倍，而在處理組中，根際土比非根際土高1.9－2.0倍。

表1 供試土壤和蚯蚓糞肥基本理化性質Table 1 Physical and chemical characteristics of the experimental soil and vermicompost

圖1 不同蚯蚓糞肥添加水平土壤微生物生物量碳、微生物生物量磷和微生物生物量碳磷比的變化Fig. 1 Change of soil microbial biomass C, microbial biomass P and microbial biomass C/P among different vermicompost treatments

2.2 蚯蚓糞肥對非根際土酸性磷酸酶活性的影響

酸性磷酸酶活性變化如圖2，在0－4 d隨著培養時間的延長，對照組和處理組的酸性磷酸酶活性均呈明顯上升趨勢，14－35 d均趨于穩定。在整個培養過程處理組的酸性磷酸酶活性均極顯著高于對照組，且隨施入的蚯蚓糞肥質量增加而增加，但蚯蚓糞肥施入超過一定量時，酸性磷酸酶活性增加幅度有所降低。

圖2 不同蚯蚓糞肥添加水平土壤酸性磷酸酶活性的變化Fig. 2 Change of soil acid phosphatase activity among different vermicompost treatments

2.3 蚯蚓糞肥處理下非根際土有效磷和各形態有機磷含量的變化

圖3 培養期間不同蚯蚓糞肥處理水平土壤有效磷和各形態有機磷質量濃度變化情況Fig. 3 Change of soil available P and organophosphorus species activity contents among different vermicompost treatments during the period of culture

不同蚯蚓糞肥質量水平添加下非根際土有效磷含量變化情況如圖 3a所示，在整個培養期間各組土壤有效磷含量均表現為0－7 d上升，7－35 d下降，且隨著施入的蚯蚓糞肥質量水平的提高而增加，通過相關性分析發現在各處理組之間土壤有效磷含量差異極顯著。NaHCO3-Po主要為吸附在土壤顆粒表面的活性有機磷和微生物生物量磷，易礦化為植物所吸收利用，其含量變化情況如圖3b，在培養期間各處理組土壤 NaHCO3-Po含量變化趨勢表現為0－7 d快速上升，7－21 d快速下降，21－35 d平緩下降，其中至培養末期A2、A3組下降幅度最大，分別下降 8.28 mg·kg-1和 6.23 mg·kg-1，而 CK和A1的NaHCO3-Po含量則在整個培養期間略微下降，總體上土壤NaHCO3-Po含量隨施入的蚯蚓糞肥質量水平提高而上升。NaOH-Po主要指通過化學吸附而緊密結合于土壤鐵鋁氧化物表面的中穩定性有機磷，是有效磷的重要潛在供給源，其含量變化情況如圖3c所示，從CK到A3 4個組土壤NaOH-Po含量在0－14 d微有上升，總體上隨時間增長均呈緩慢下降趨勢，其中對照組至培養末期僅下降0.49 mg·kg-1，處理組下降 17.24－31.69 mg·kg-1，以 A2和A3下降幅度最大。在整個培養期間處理組土壤NaOH-Po含量均極顯著高于對照組，且隨著施入的蚯蚓糞肥質量水平的提高而增大。C.HCl-Po為濃鹽酸提取的有機磷，也可歸為殘渣態磷，屬于穩定性磷，其在土壤中極難被植物所利用，其含量變化情況如圖 3d，各組土壤 C.HCl-Po含量在培養期間變化趨勢較一致，0－14 d總體上均呈快速上升趨勢，14 d后趨于穩定，至培養末期，各處理組土壤C.HCl-Po含量上升幅度均明顯高于對照組，其中A2 和 A3 分別上升 9.27 mg·kg-1和 9.14 mg·kg-1，差異性分析表明21－35 d A2和A3兩組之間含量差異均不顯著。

2.4 酸性磷酸酶活性、微生物生物量磷、有效磷以及各磷形態的相關性分析

各蚯蚓糞肥處理組土壤相關性分析結果表明：蚯蚓糞肥處理的土壤中酸性磷酸酶活性與NaOH-Po之間均存在顯著負相關關系（表 2）；微生物生物量磷與NaOH-Po之間呈極顯著負相關，在A2和A3水平下，微生物生物量磷還與NaHCO3-Po之間存在顯著負相關關系，NaHCO3-Po與NaOH-Po存在顯著正相關關系，穩定態有機磷 C.HCl-Po與NaOH-Po、NaHCO3-Po均呈顯著負相關。

3 討論

土壤微生物生物量是土壤中養分循環和轉化的動力，同時也是植物有效養分的儲備庫，在土壤中微生物生物量對土壤環境因素變化極為敏感（樊曉剛等，2010），其中微生物生物量碳是土壤中有機碳最活躍的部分，因其在土壤中變化趨勢與土壤有機質分解進程關系密切，可作為衡量土壤活性大小的重要指標，而微生物生物量磷則是植物有效磷的重要來源，微生物對磷素的固持可促進土壤中磷素的周轉，提高土壤活性磷含量。本研究結果表明，施加蚯蚓糞肥對根際土壤和非根際土壤微生物生物量碳、微生物生物量磷均具有顯著提高作用，其中大于 A2水平處理效果最好，這和白文娟等（2018）研究結果較一致，已有研究發現土壤中C/N比對微生物活性具有較大影響（Matschullat et al.，2018；王爭妍等，2017），在充足的氮素供給下，蚯蚓糞肥添加對土壤有機碳尤其是水溶性有機碳含量的提高帶動了微生物活性的提高，除此之外，蚯蚓糞肥優良的通氣性和排水持水能力、較全面的營養物質以及良好孔隙結構等特點更為土壤中微生物營造了一個優質的生存環境（Abdissa et al.，2018），這些影響因素均有利于土壤微生物快速增殖，同時也是微生物生物量磷含量升高的主要原因。根際為根系-微生物-土壤相互作用的微型區域，因此根際土壤物理化學以及生物學性質與非根際土壤存在顯著區別。根際土壤中微生物生長主要受到兩方面的影響，一方面為植物在生長過程中通過根系分泌有機酸、糖類、生長素和酶等對微生物的活動的調節，另一方面根際微環境內土壤對微生物養分和能源物質的持續供給，這兩方面導致植物根際土壤微生物生物量碳含量往往高于非根際土（趙輝等，2010），這和本研究結果相同。土壤微生物生物量磷為微生物固定在自身體內的磷，其含量既取決于微生物的數量也取決于微生物的種類（陳智裕等，2017）。本研究發現微生物生物量磷在對照組根際土中顯著高于非根際土，而在各蚯蚓糞肥處

理組的根際土中則均顯著低于非根際土，結合根際微生物量碳顯著高于非根際土的實際情況，在不受植物根系調節下，蚯蚓糞肥能顯著提高土壤解磷或貯磷微生物數量及比例，主要原因可能為植物根系對根際土壤游離磷素的吸收，導致根表面正磷酸根離子濃度下降而顯著低于非根際土，從而影響解磷或貯磷微生物的生長以及對磷素的吸收，而非根際土微生物對磷的貯存同時也一定程度上促進了有效磷素向根系的質流和擴散。通過相關性分析發現，施加蚯蚓糞肥的非根際土壤中微生物生物量磷、酸性磷酸酶活性均與NaOH-Po之間呈極顯著負相關關系，表明酸性磷酸酶對蚯蚓糞肥施加后土壤豐富的 NaOH-Po具有顯著的水解作用，同時NaOH-Po也成為土壤解磷和貯磷微生物的主要磷源。而各組土壤微生物生物量磷與酸性磷酸酶活性呈極顯著正相關關系，則表明了土壤中 NaOH-Po的活化不主要以微生物對碳的需求來驅動。酸性磷酸酶是一種主要由植物、細菌和真菌分泌的蛋白酶，可水解有機磷底物上的磷酸基團，生成可被植物和微生物直接吸收的磷酸根離子（Luo et al.，1994）。蚯蚓糞肥富含有機質的同時能夠刺激微生物生長，其中鐵還原菌為土壤中主要的一類能夠異化還原Fe(Ⅲ)獲得能量的微生物（Margalef et al.，2017），其對高價鐵的還原以及有機物對鐵的螯合均可促進 NaOH-Po的釋放（令狐榮云等，2016），從而使其更易被礦化而為微生物所吸收。另有研究表明，Mg2+、Mn2+、部分腐殖酸類物質等可作為提高土壤酸性磷酸酶活性的激活劑（沈菊培，2005；房娜娜，2008）。除此之外，有機磷化學結構也對磷酸酶水解難易具有較大影響，蚯蚓糞肥提高了土壤 NaOH-Po中較易被酸性磷酸酶分解的組分也可能為促進 NaOH-Po礦化的重要原因。NaHCO3-Po為土壤中活性最高同時也是含量最低的有機磷，通過相關性分析發現，隨著蚯蚓糞肥施加量的提高，NaHCO3-Po與微生物生物量磷、NaOH-Po之間的相關性均逐漸增強，在A2和A3處理中相關性均達顯著水平，這可能主要與 NaOH-Po解吸附活化有關，蚯蚓糞肥施入土壤不斷產生 NaHCO3-Po，NaHCO3-Po活性高的特點使其作為微生物能源物質的同時也作為微生物重要的碳源和磷源。C.HCl-Po在土壤中難以被活化，蚯蚓糞肥顯著提高土壤活性磷含量的同時也促進了C.HCl-Po的蓄積，通過相關性分析發現對照組和各處理組 C.HCl-Po均與微生物生物量磷、Olsen-P極顯著相關，其中在各處理組中 C.HCl-Po與微生物生物量磷的相關性均大于C.HCl-Po與Olsen-P之間的相關性，另外在A2、A3處理下C.HCl-Po均與NaHCO3-Po、NaOH-Po呈顯著負相關，而 NaHCO3-Po包括土壤中微生物生物量磷，綜合上述NaOH-P與微生物生物量磷之間關系的分析可知，蚯蚓糞肥作用下土壤中C.HCl-Po的合成主要與微生物生物量磷存在重要關系，這可能與土壤微生物生物量磷周轉有關，已知核酸和磷脂為微生物體中最主要的含磷成分，在蚯蚓糞肥添加環境下，微生物死亡后核酸和磷脂被釋放，隨后發生的某些生物化學反應過程可能與 C.HCl-Po的合成有關。

表2 土壤酸性磷酸酶活性、微生物生物量磷、有效磷以及各形態磷素之間的相關關系Table 2 Correlation between acid phosphatase activity, microbial biomass P, available phosphorus and phosphorus forms

4 結論

（1）施加蚯蚓糞肥顯著增加根際土和非根際土總微生物量以及微生物對磷的貯存量，其中非根際土中解磷或貯磷微生物量提升效果遠高于根際土，在處理組中非根際土微生物生物量碳磷比均低于根際土1.9－2.0倍，在對照組中非根際土低于根際土0.3倍，而當蚯蚓糞肥施入量超過80 g·kg-1水平時，土壤微生物生物量磷以及微生物生物量碳均不再發生顯著變化。

（2）蚯蚓糞肥處理的非根際土壤中微生物生物量磷、酸性磷酸酶活性均與NaOH-Po呈極顯著負相關關系，而微生物生物量磷與酸性磷酸酶活性呈極顯著正相關關系，表明蚯蚓糞肥對土壤酸性磷酸酶活性具有顯著提高作用，有效促進NaOH-Po活化，同時蚯蚓糞肥處理的土壤中豐富的 NaOH-Po礦化促進了土壤微生物對磷的貯存。

（3）蚯蚓糞肥在加速土壤 NaHCO3-Po和NaOH-Po礦化的同時也促進了C.HCl-Po的合成，其中在各處理組中 C.HCl-Po均與微生物生物量磷呈極顯著正相關，80、120 g·kg-1處理下與 NaHCO3-Po、NaOH-Po均呈顯著負相關，表明蚯蚓糞施入處理下C.HCl-Po的合成主要與微生物生物量磷顯著相關。