東江下游典型飲用水源地抗生素抗性基因分布研究

房平，代鶴峰, ，莊僖，謝宏琴，羅偉鏗，任明忠，鄭晶*

1. 西安工程大學(xué)城市規(guī)劃與市政工程學(xué)院，陜西 西安 710600；2. 國家環(huán)境保護環(huán)境污染健康風(fēng)險評價重點實驗室，廣東 廣州 510535；3. 東莞市環(huán)境監(jiān)測中心站，廣東 東莞 523000

自1929年英國科學(xué)家Flming發(fā)現(xiàn)青霉素以來，抗生素得到迅速發(fā)展，種類不斷豐富（蘇懷德，1988），被廣泛用于人類醫(yī)療、家禽養(yǎng)殖、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖（曾冠軍等，2017；程憲偉等，2017），但這些用于醫(yī)療、養(yǎng)殖的抗生素并不能被全部被吸收，80%以上的抗生素以其原始形態(tài)被輸送至環(huán)境中（Sarmah et al.，2006）。隨著抗生素的濫用，細(xì)菌對環(huán)境中的抗生素產(chǎn)生了抗性（Inyinbor et al.，2018），抗生素抗性基因（Antibiotics Resistance Genes，ARGs）作為一種新型的環(huán)境污染物由Pruden et al.（2006）明確提出。中國作為抗生素的使用大國，濫用抗生素嚴(yán)重影響環(huán)境中ARGs的豐度水平，因此對中國環(huán)境中ARGs污染進行檢測研究非常有必要性（羅義等，2008）。

隨著國內(nèi)對 ARGs污染的重視，針對 ARGs的研究發(fā)現(xiàn) ARGs在土壤、空氣和水體中均有分布（張俊等，2014；張?zhí)m河等，2016；高敏等，2017；高盼盼等，2009）。水環(huán)境中ARGs污染水平受多種因素的影響，例如，鄒世春等（2009）對北江河水中ARGs進行研究，發(fā)現(xiàn)sul1與sul2兩種基因的污染水平與該水域中磺胺類抗生素的含量分布有關(guān)，說明外源性抗生素對河流的污染是誘導(dǎo) ARGs的重要因素；趙曉祥等（2018）發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)水體中的 ARGs與微生物、溫度、懸浮物等影響因素相關(guān)。

飲用水源地水質(zhì)問題關(guān)系到居民的健康安全，因此飲用水源中 ARGs的污染水平也日益得到關(guān)注，雖然目前對水環(huán)境中ARGs的研究很多，但是針對飲用水源地中ARGs的研究卻相對較少。本文主要研究東江下游典型的河流型飲用水源地和湖泊型水源地水體中ARGs的分布，對3類8種ARGs進行檢測，探究水源地類型與ARGs的關(guān)系，及部分影響因素和ARGs之間的相關(guān)性，為飲用水源地的抗性基因污染狀況及生態(tài)風(fēng)險管理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

StepOnePlus? Real-Time PCR（Polymras Chain Raction）儀（美國ABI公司），Sorvall ST16R通用冷凍離心機（美國Thermo公司），Mupid-exu電泳儀（日本TAKARA公司），孔徑0.45 μm直徑47 mm玻璃纖維濾紙，ABI Veriti96 PCR儀（美國ABI公司），DNeasy PowrWater水樣微生物DNA提取試劑盒（德國QIAGEN GmbH公司）。

1.2 采樣位點

于2018年3月選取東江下游地區(qū)河流型飲用水源保護區(qū)9個（其中6個采樣點布設(shè)在供水廠取水口）和湖泊型水源地5個監(jiān)測點進行采樣（如圖1），其中YY-1－YY-3為東江下游干流水源地采樣點，GS-1－GS-6為供水廠取水口，SK-1－SK-5為湖泊型水源地（全部為備用水源地）采樣點。

1.3 水樣采集

每個點位采集水樣2 L，水樣采集深度在水面以下0.5－1.0 m之間，水樣采集完畢后現(xiàn)場使用美國HQd便攜式水質(zhì)分析儀檢測pH、溶解氧（DO）兩個指標(biāo)，指標(biāo)檢測完畢之后迅速將水樣置于冷藏箱中于12 h內(nèi)運送至實驗室并儲存于4 ℃環(huán)境下。

1.4 DNA提取

所采水樣用0.45 μm玻璃纖維濾膜通過規(guī)格1 L的溶劑過濾器過濾，過濾后的濾膜置于4 ℃下冷藏，用于DNA的提取。使用DNeasy PowrWater水樣微生物 DNA提取試劑盒提取濾膜上的 DNA，DNA提取按照德國QIAGEN GmbH公司所提供方法進行操作。

1.5 ARGs的普通PCR擴增

本研究的目的基因包含磺胺類 ARpHGs 3種（sul1、sul2、sul3），四環(huán)素類 ARGs 4種[tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(G)]，大環(huán)內(nèi)酯類 ARGs 1種（ermB）。對所提取的水樣中的DNA進行檢測，目的ARGs引物詳細(xì)信息見表1。普通PCR擴增實驗采用25 μL反應(yīng)體系。

普通 PCR 25 μL 反應(yīng)體系：Premix Taq（Ex Taq version 2.0 plus dye）（日本 TAKARA）12.5 μL；上下游引物各 1 μL；模板 DNA 1 μL；ddH2O 9.5 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性15 s；退火（各引物的退火溫度見表1）30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。得到的產(chǎn)物置于4 ℃低溫冷藏保存，用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。

1.6 實時熒光定量PCR

實時熒光定量 PCR使用 ABI StepOnePlus?Real-Time PCR儀器進行測定。根據(jù)實驗結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對待測樣品進行豐度檢測。

Realtime PCR反應(yīng)體系：SYBR?Fast qPCRmix 12.5 μL，上下游引物 10 μmoL·L-1各 0.5 μL，DNA模板1 μL添加ddH2O至體積為25 μL。

圖1 東江下游典型飲用水源地采樣點位分布圖Fig. 1 Sampling point distribution map of typical drinking water sources in the lower Dongjiang River

表1 ARGs引物及退火溫度Table 1 Primers of ARGs and annealing temperature

反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性15 s，退火（各引物的退火溫度）30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線實驗所用到的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的引物序列及片段長度如表2所示。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒交由生工生物工程（上海）有限公司進行合成。質(zhì)粒合成后，將質(zhì)粒按照10∶1的比例稀釋成7個梯度的DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為 103－109copies·L-1。

實驗得到的8種ARGs的線性方程相關(guān)系數(shù)均≥0.99，其相關(guān)系數(shù)與擴增效率如表2所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARGs的檢出率與豐度水平

表 3所示為各點位 ARGs的絕對豐度（單位copies·L-1）與 pH、DO 值。如表所示，磺胺類的sul1、sul2，檢出率達到 100%，sul3的檢出率也達到85.7%，這表明東江下游水源地普遍受到磺胺類抗生素的污染。四環(huán)素類的tet(G)檢出率為100%，其次tet(O)、tet(M)檢出率為92.9%，tet(Q)的檢出率略低為 64.3%，大環(huán)內(nèi)酯類ermB的檢出率最低，僅為50%。ARGs檢出率反映了水體受抗生素污染的種類有所不同，磺胺類和四環(huán)素類ARGs的高檢出率與文獻報道東江抗生素污染種類相吻合（趙騰輝等，2016）。

從表3可知，sul1的豐度水平最高，其絕對豐度范圍為 2.37×107－4.79×108copies·L-1，sul2、tet(O)、tet(G) 3種ARGs的豐度水平相對較高，處于 103－105copies·L-1，tet(M)與ermB的豐度水平相對較低，在103－104copies·L-1之內(nèi)，sul3的豐度水平最低，僅達到 102－103copies·L-1級別，遠(yuǎn)低于sul1與sul2的豐度水平，這可能與sul3的檢出率較低有關(guān)（Hoa et al.，2008）。

表2 ARGs標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 ARGs standard curve

東江下游典型飲用水源地ARGs污染水平較以往研究報道的水環(huán)境中ARGs研究結(jié)果低。張瑞全等（2013）報道東江流域西枝江sul1基因豐度水平為 9.78×106－9.94×108copies·L-1，sul2 基因的豐度水平在 1.49×105－2.77×108copies·L-1之間，sul3 基因豐度水平在 7.52×104－1.66×106copies·L-1，總體上高于本研究檢出的sul1、sul2、sul3基因豐度，西枝江位于本研究河流區(qū)域段上游，是東江一級支流，非飲用水源保護區(qū)，是上游工農(nóng)業(yè)排水的受納水體。Jiang et al.（2013）對上海黃浦江及飲用水中ARGs與抗生素的關(guān)系進行研究，其檢測結(jié)果表明，黃浦江sul1基因豐度水平為 3.2×107－1.74×108copies·L-1，sul2 基因的豐度水平在 4.3×107－4.19×108copies·L-1之間，tet(M)基因豐度水平為2.3×103－5.07×103copies·L-1，tet(O)基因豐度水平為 1.43×103－5.05×103copies·L-1，除sul2 基因豐度水平比本研究低外，其他3種基因豐度水平與本研究中ARGs豐度水平相差不大；Jiang（2013）選擇黃浦江上游5個點作為研究對象，其中4個為非飲用水源保護區(qū)，1個為水源保護區(qū)，通過對比發(fā)現(xiàn)其作為飲用水源保護區(qū)的S2采樣點所有ARGs的豐度水平均低于非飲用水源保護區(qū)的豐度水平。天津海河流域（楊繼平等，2017）、黃浦江流域（沈群輝等，2012）、華東地區(qū)水源地（胡亞茹等，2018）和新疆瑪納斯河流域（周婷等，2014）檢出的抗性基因sul1、sul3、ermB、tet(O)、tet(M)等的豐度水平也均高于本研究。通過對比研究發(fā)現(xiàn)，東江下游典型飲用水源地ARGs污染水平相對較低，飲用水源地的嚴(yán)格的保護制度和措施有助于減少抗生素抗性基因的污染。

表3 各點位ARGs的絕對豐度（單位copies·L-1）與pH、DO值Table 3 Absolute abundance (unit copies·L-1) and pH, DO value of ARGs at different sites

表4所示為ARGs之間及抗性基因與水質(zhì)指標(biāo)（pH和DO）的相關(guān)性。從表中可以看出，抗性基因的豐度與pH值、溶解氧等因素都具有顯著的相關(guān)性（P＜0.05），除sul2 與tet(O)、tet(M)與tet(Q)外，其他抗性基因之間也有顯著的相關(guān)性（P＜0.05），說明同類整合子各部分之間存在較強的相關(guān)性，此結(jié)果與Su et al.（2018）對飲用水系統(tǒng)抗性基因的研究結(jié)果類似。本研究水樣的pH值在7.11－8.68之間，為弱堿性水環(huán)境，sul3、tet(O)、tet(Q)與pH值呈正相關(guān)，其他5種基因與pH值呈負(fù)相關(guān)，說明含有sul3、tet(O)、tet(Q)基因的微生物適宜在弱堿環(huán)境下生存。溶解氧 DO的范圍為4.74－10.19 mg·L-1，范圍覆蓋從高至低，對水環(huán)境中ARGs的影響并不明確，與趙曉祥等（2018）發(fā)現(xiàn)的水體溶解氧對 ARGs豐度影響不明確的結(jié)論相一致。

表4 ARGs的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of ARGs

2.2 ARGs空間分布特征

河流中抗生素基因污染水平主要受沿江污染源輸入的影響，本研究河流型水源地的9個采樣點位（YY-1－YY-3，GS-1－GS-6）沿著東江自上而下分布，將各點位每一類抗性基因豐度進行相加得到總豐度，并將總豐度按沿江采樣點從上游至下游進行擬合得到圖2，可以看出東江河流型水源地總抗性基因豐度水平大致是沿著河流方向呈逐漸增大的趨勢，進一步分析表明水體中總抗性基因水平主要受到沿江城鎮(zhèn)分布的影響（張丹丹等，2018）。如圖2所示，YY-1與GS-1相比，總抗性基因水平明顯降低，該流段ARGs累積速率為負(fù)數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，結(jié)合該段流域地形和社會經(jīng)濟狀況，該江段基本沒有大型城鎮(zhèn)和工業(yè)區(qū)分布，水體中的抗性基因受自然衰減作用而有所降低。從YY-1－GS-6，水體中總抗性基因豐度水平急劇上升，累積速率達到0.053，這可能主要是這段流經(jīng)企石鎮(zhèn)鎮(zhèn)區(qū)；GS-6－GS-5－GS-3總ARGs豐度略有增加，保持平穩(wěn)的較高水平，主要還是受該段高度城市化的影響。GS-3－YY-2和GS-3－GS-4至YY3，總ARGs豐度水平明顯下降，GS-3之后東江干流分東江北干流和南干流，北干流的采樣點為GS-4和YY-3，所處區(qū)域經(jīng)濟水平相對落后，人口分布少，因此水體中總 ARGs豐度水平持續(xù)下降；南干流采樣點YY-2－GS-2，總抗性基因豐度水平又急劇上升，達到東江下游地區(qū)至上而下河流型水源地采樣點中的最高水平，這主要是受江段流經(jīng)東莞市主城區(qū)的影響。

圖2 河流型水源地ARGs沿河流方向分布規(guī)律Fig. 2 Distribution of ARGs in fluvial water source area along river direction

2.3 河流型水源地與湖泊型水源地 ARGs豐度對比

為比較東江下游地區(qū)河流型水源地和湖泊型飲用水源地ARGs豐度差異，按不同類型的水源地樣本的ARGs豐度分別進行了統(tǒng)計分析（見表5）。河流型水源地的sul1豐度均值為 1.31×108copies·L-1，最高值為 2.88×108copies·L-1，其他 7種抗性基因豐度水平均值為3.25×105copies·L-1，最高值為 8.17×105copies·L-1，最高值均出現(xiàn)在下游GS-2，GS-2處于東莞主城區(qū)下游，可能主要受到城市面源的影響，ARGs污染明顯高于其他采樣點位。湖泊型水源地sul1的平均水平 5.47×107copies·L-1，最高值為 4.79×108copies·L-1，其他 7種抗性基因豐度水平均值為3.73×105copies·L-1，最高值為 1.41×106copies·L-1，最高值均出現(xiàn)在備用水源 SK-5，經(jīng)調(diào)研，SK-5檢出高豐度 ARGs，原因是在作為備用水源之前，該水庫的水環(huán)境功能是工農(nóng)業(yè)綜合用水，水庫曾經(jīng)進行過大面積水產(chǎn)養(yǎng)殖，水產(chǎn)養(yǎng)殖投加了大量的抗生素，即使這幾年加強了保護，仍然導(dǎo)致抗生素抗性基濃度水平高，甚至高于GS-2，是所有采樣點中污染程度最高的點位。總體上，東江下游地區(qū)河流型水源地的抗性基因污染高于湖泊型水源地，這是由于東江下游湖泊基本上處于東江支流的上游地區(qū)，受到城市面源和上游輸入影響較小，同時近年來通過禁養(yǎng)等措施能夠有效降低抗生素污染。

3 結(jié)論

（1）東江下游典型飲用水源地ARGs絕對豐度水平在 2.37×107－4.80×108copies·L-1之間，磺胺類和四環(huán)素類ARGs檢出率高，ARGs污染水平較國內(nèi)其他水體低。

（2）東江下游河流型飲用水源地中抗生素基因豐度水平總體上呈現(xiàn)上游點位低于下游點位，沿江城市面源是影響水源地ARGs豐度水平變化的重要因素之一。

（3）東江下游地區(qū)河流型飲用水源地ARGs污染水平總體上高于湖泊型飲用水源地，禁養(yǎng)措施的實施有效降低了湖泊型水源地ARGs豐度水平。

表5 各點位sul1與其他7種ARGs豐度水平分析Table 5 Analysis of abundance levels of sul1 and other 7 ARGs at different sites copies·L-1