腐植酸對鎘脅迫下油菜生長及抗氧化系統的影響

肖丹丹 蘇秀榮 吳欽泉 宋以玲 路艷艷 陳士更 丁方軍 ，4

1 農業農村部腐植酸類肥料重點實驗室 泰安 271600

2 山東農大肥業科技有限公司 泰安 271600

3 山東農業大學化學學院 泰安 271600

4 土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東農業大學資源與環境學院 泰安 271600

近年來，隨著工農業生產的發展，工業“三廢”排放量增加，固體廢棄物處理不善，農業自身污染加劇，這些有毒重金屬會通過植物吸收重金屬經食物鏈進入人體，嚴重威脅人類健康。因重金屬具有毒性強、長期性和非生物降解性，以致土壤重金屬污染成為當今嚴重的環境問題，鎘（Cd）已被公認為是毒性最強的元素之一[1]。目前我國部分區域土壤Cd污染問題非常嚴峻，例如：上海螞蟻浜地區污染土壤Cd的質量分數達21.48 mg/kg，廣州郊區老污灌區土壤Cd的質量分數高達228.00 mg/kg，沈陽張士灌區一閘土壤Cd的質量分數達5.00～76.68 mg/kg[2]。因此，研究重金屬Cd對植物生理作用的影響具有重要意義[3～6]。

研究發現，向Cd污染土壤中施入腐植酸（HA），可增強土壤對重金屬Cd的固定，提高土壤對重金屬Cd的鈍化作用，減少植物的吸收，阻礙Cd進入食物鏈[7]。一方面可能是腐植酸含有大量的羥基、羧基、羰基、甲氧基等官能團，能與Cd結合，形成螯合物和絡合物等形態，促使土壤中交換態Cd向鐵錳氧化物態、殘渣態轉換，從而降低其生物活性；另一方面，可能是腐植酸影響土壤的其他基本性狀，間接影響土壤Cd有效性；而且腐植酸在農業生產中具有“改良土壤、增效化肥、刺激生長、增強抗逆、改善品質”五大作用。因此，本研究以油菜為材料，研究了腐植酸對Cd（60 mg/kg）脅迫下油菜體內Cd、硝態氮含量，過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，以及丙二醛（MDA）含量和超氧陰離子自由基（O2·-）產生速率等生理特性的影響，探討腐植酸緩解重度Cd脅迫的生理機理，為探明腐植酸緩解植物Cd毒害機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗在山東省泰安市肥城市山東農大肥業科技有限公司試驗基地進行。供試肥料為普通白粒復合肥N-P2O5-K2O（24-12-12），由該公司提供。供試土壤為棕壤，取自本公司試驗田，其基本理化性質：pH 6.34，堿解氮66.37 mg/kg，全氮0.56 g/kg，有效磷21.45 mg/kg，速效鉀33.18 mg/kg，有機質10.81 g/kg，土壤Cd 0.01 mg/kg。供試油菜品種為“華綠一號”。供試腐植酸由山東創新腐植酸科技股份有限公司提供，其基本理化性質：pH 6.7，總腐植酸含量37.1%（濕基），游離腐植酸含量16.9%（濕基），E4/E6=4.7，含水量28%。

1.2 試驗方法

本試驗為盆栽試驗。在試驗田取5～20 cm表層土，晾曬風干后過2 mm篩備用。以溶液形式加入CdSO4·10H2O，Cd濃度為60 mg/kg（參照我國部分鎘污染區域土壤鎘質量分數設計），處理濃度分別以純Cd計。以不加Cd處理作對照。土壤加入Cd溶液后，充分混勻，保持土壤持水量70%，平衡10天，然后風干，分別與不同量的腐植酸混勻后裝盆，每盆盛土3.0 kg。每盆施復合肥1 g，每個處理重復3次，隨機區組排列。各處理詳見表1。

表1 試驗處理Tab.1 The experimental treatment

1.3 測量指標及方法

油菜體內Cd含量測定采用GB 5009.15-2014，硝態氮含量測定采用紫外吸收法[8]。POD活性的測定采用愈創木酚法，以每分鐘A470上升0.01為1個酶活性單位（U），以U/（min·g FW）表示。SOD活性測定采用氮藍四唑法（NBT），以NBT光化還原被抑制50%的酶液量為1個酶活性單位，以U/（g FW）表示。CAT活性的測定采用紫外吸收法，以每分鐘A240減少0.1的酶量為1個酶活性單位，以U/（min·g FW）表示。MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法。O2·-產生速率的測定采用羥胺氧化法[9]。

酶液制備：取0.5 g油菜葉片，加入5 mL濃度為0.05 mol/L，pH為7.8的磷酸緩沖液在冰浴下研磨至勻漿，勻漿倒入離心管中，低溫（0～4 ℃）離心20 min，轉速為10000轉/分鐘。上清液倒入離心管中，至0～4 ℃保存備用。

1.4 數據統計分析

數據采用Microsoft Excel 2007 軟件進行繪圖，用DPS 9.50軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對Cd脅迫下油菜Cd含量的影響

圖1為不同處理對Cd脅迫下油菜Cd含量的影響。由圖可見，與對照相比，單獨Cd脅迫條件下，顯著提高了油菜葉片和根系內Cd含量，添加不同用量的HA處理均顯著降低了油菜葉片和根系內Cd含量，且隨著HA添加量的增加，油菜葉片和根系內Cd含量呈現先顯著降低，后趨于平穩的趨勢。當HA添加量為2 g/kg時，與單獨Cd脅迫處理相比，油菜葉片和根系內Cd含量分別顯著降低了59.2%和30.9%，且當HA添加量高于2 g/kg后，與2 g/kg處理對比，對油菜葉片和根系內Cd含量無顯著影響。因此，HA添加量達2 g/kg時，抑制油菜對土壤內Cd的吸收效果最佳。

2.2 不同處理對Cd脅迫下油菜體內酶活性的影響

植物在生長過程中難免會遭受生物和非生物逆境脅迫，其代謝過程就會產生自由基破壞細胞膜；POD、SOD、CAT作為植物自身的酶保護系統，可通過各種代謝過程來清除自由基，降低氧化損傷[10]。在一定程度上清除各種逆境因子脅迫下所產生的活性氧，使體內活性氧維持在一個相對穩定的水平，從而有效地阻止過氧化物質在植物體內積累[11]。表2為不同處理對Cd脅迫下油菜體內酶活性的影響。由表可知，與CK相比，單獨Cd脅迫條件下，顯著降低了油菜體內POD、SOD和CAT活性，表明Cd脅迫下，致使油菜體內部分酶失活，從而導致油菜體內抗氧化系統失衡。油菜葉片出現失綠、變黃、葉尖卷曲變干等癥狀時，表明油菜已經出現中毒現象。在Cd脅迫下，施用HA后，油菜體內POD、SOD、CAT活性升高，且SOD和POD活性均隨HA添加量的增多而逐漸升高。當HA添加量達到1 g/kg時，SOD和CAT活性與正常處理相比，無顯著差異，說明添加HA明顯緩解了Cd脅迫對油菜體內POD、SOD和CAT活性的抑制作用，提高了油菜的抗氧化能力，緩解了Cd脅迫造成的氧化損傷，增強了油菜抵抗Cd脅迫的能力。

圖1 不同處理對Cd脅迫下油菜Cd含量的影響Fig.1 Effects of different treatments on Cd content in rape under Cd stress

表2 不同處理對Cd脅迫下油菜體內酶活性的影響Tab.2 Effects of different treatments on activities of enzymes in rape under Cd stress

2.3 不同處理對Cd脅迫下油菜體內MDA含量和O2·-產生速率的影響

MDA是在植物器官衰老或逆境條件下，發生膜脂過氧化作用而產生的最終分解產物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。圖2為不同處理對Cd脅迫下油菜體內MDA含量和O2·-產生速率的影響。由圖可見，Cd脅迫條件下，顯著提高了油菜體內MDA含量，添加HA后其含量不斷降低，均與單獨Cd脅迫處理間存在顯著性差異，且隨HA添加量的增加而逐漸降低。O2·-是植物體內的第一個氧自由基，在細胞信號轉導和氧感應方面具有重要的作用，濃度適宜時可作為胞內信號分子，但含量過高時又會引起自由基鏈鎖反應，最終轉化成H2O2、羥基自由基（·OH）和單線態氧（1O2）等自由基，而導致氧化損傷[12]。由圖2可見，Cd脅迫條件下，油菜葉片內O2·-產生速率顯著高于CK，添加HA后，O2·-產生速率的變化趨勢與MDA相似，均隨HA添加量的增多而降低。以上結果表明，HA可通過提高Cd脅迫下油菜體內抗氧化物酶的活性來降低MDA含量和O2·-產生速率，減輕油菜體內膜脂過氧化損傷，從而提高油菜的抗逆性。

圖2 不同處理對Cd脅迫下油菜體內MDA含量和O2·-產生速率的影響Fig.2 Effects of different treatments on MDA content and the generation of O2·- in rape under Cd stress

2.4 不同處理對Cd脅迫下油菜體內硝態氮含量的影響

硝態氮是植物的重要氮源，植物體內硝態氮含量可以反映土壤氮素供應情況。特別是葉菜類和根菜類蔬菜中常含有大量硝酸鹽，在烹飪和腌制過程中可轉化為亞硝酸鹽而危害健康。因此，硝酸鹽含量高低是衡量蔬菜品質、安全性的一個重要指標，同時能夠反映作物的氮素營養狀況[13]。圖3為不同處理對Cd脅迫下油菜體內硝態氮含量的影響。由圖可見，單獨Cd脅迫條件下，油菜體內硝態氮含量明顯升高，但差異不顯著，而隨著HA添加量的增加，油菜葉片內硝態氮含量顯著降低，且低于對照處理，差異達顯著水平。說明HA對降低Cd脅迫下油菜體內硝態氮的形成和累積有很好的效果，且低于非Cd脅迫下油菜體內硝態氮的含量。

圖3 不同處理對Cd脅迫下油菜體內硝態氮含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on nitrate nitrogen content in rape under Cd stress

3 討論與結論

張樹杰等[14]認為Cd脅迫顯著抑制了油菜幼苗的生長，植株根系和地上部干重隨著Cd濃度的升高而顯著降低；同時，油菜幼苗體內抗氧化酶（POD、SOD和CAT）活性在高濃度Cd脅迫時顯著降低。劉麗莉等[15]研究表明，Cd脅迫濃度達到600 μmol/L時，顯著提高了油菜體內MDA含量，降低了SOD和CAT活性，從而降低了油菜抗氧化酶保護系統的功能，加劇了膜系統的氧化損傷。

任學軍等[16，17]研究表明，HA能明顯降低小麥幼苗體內Cd含量；能顯著降低Cd污染土壤種植小白菜體內重金屬Cd的積累量，且對重金屬Cd積累的抑制效應隨HA添加量的增多而逐漸增強，并獲得了最佳的添加范圍，即1.0～2.0 g/kg。彭正萍等[18]研究認為，HA能顯著降低油菜體內硝酸鹽含量，提高Vc、可溶性糖含量以及POD和SOD活性。本研究與以上研究結論基本一致，具體為：在Cd脅迫下，添加不同用量HA，油菜體內Cd含量隨HA添加量的增加而降低，HA最佳添加量為2 g/kg；土壤中添加HA后降低了油菜體內硝態氮含量，提高了POD、SOD和CAT活性，降低了MDA含量和O2·-產生速率，促使油菜抗氧化酶系統恢復平衡、膜脂過氧化得到緩解。因此，在Cd含量較低，污染程度輕的土壤上有望通過添加一定用量的HA來降低Cd在作物體內的累積，以達到食物所要求的最低檢出限，提高產品安全性。但仍需針對不同程度Cd污染土壤、不同作物以及腐植酸產品種類和用量等做相關研究。