恩拉霉素人工抗原合成工藝的優化

余 華， 葉健強， 嚴玉寶， 謝 晶， 胡 娟， 康潤敏， 周岷江， 廖黨金， 崔鵬博， 葉勇剛， 于吉鋒， 肖 璐， 曹 冶， 魏 甬， 李興玉， 林 毅， 潘 夢， 戴卓建

(1.四川出入境檢驗檢疫局， 四川 成都 610041； 2.四川省畜牧科學研究院， 四川 成都 610066； 3.動物遺傳育種四川省重點實驗室， 四川 成都 610066)

恩拉霉素(Enramycin，Er)，又名安來霉素和持久霉素，由日本武田藥品研究所于1966年發現，是放線菌(StreptomycesfungicidiousNO. B5477)發酵產生的一種由不飽和脂肪酸和十二種氨基酸結合成的多肽類(Polypepide)抗生素[1-2]，其主要成分是恩拉霉素A(C107H138C12N26O31R=CH3)和恩拉霉素B(C108H140C12N26O31R=C2H5OH)。該藥具有很強的抗G+菌作用，用作飼料添加劑能促進畜禽生長和提高飼料效率，長期使用不易產生耐藥性，與其他抗生素亦無交叉耐藥；其化學性能穩定，無致突、致畸及致癌作用，殘留極少，適口性好。現已成為當前最具發展前景的獸用抗生素添加劑。

免疫分析法較傳統微生物檢測法、理化檢測法具有簡潔、快速、廉價、特異性強和靈敏度高等優點，已被國內外廣泛應用于獸藥殘留的檢測，但至今國內外尚無有關恩拉霉素酶免疫檢測技術的報道[3-5]，僅日本厚生省對該項殘留物質有畜、水產性食品常規檢測技術報道[6]。因此，開發我國自主產權的恩拉霉素殘留檢測方法對恩拉霉素酶免疫檢測技術具有重要意義。建立相關免疫學分析方法，制備出特異性強且效價高的恩拉霉素抗體是關鍵，必須將其與蛋白質載體等大分子載體偶聯形成人工合成的完全抗原進而制備相應抗體[7]，這也是建立免疫分析過程的前提和關鍵所在。鑒于此，在恩拉霉素人工抗原合成試驗的基礎上，采用正交試驗對抗原合成條件和主要影響因素進行優化，以期為進一步制備抗Enramycin多克隆抗體、單克隆抗體及檢測試劑盒奠定基礎，并為恩拉霉素殘留檢測方法的建立提供參考。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1試劑恩拉霉素，純度≥98%，由項目組提純；牛血清白蛋白(BSA)，相對分子質量67 kDa，上海博奧生物科技公司；卵清蛋白(OVA)，相對分子量45 kDa，上海基星生物科技公司；弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FICA)，Sigma公司；透析袋，截留分子量14 kDa，Sigma公司；戊二醛，成都金山化學試劑公司；1，4-二氧六環，成都科龍化工試劑廠；Na2HPO4·2H2O，天津博迪化工公司；NaH2PO4和Na2CO3，成都長聊化工試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉，天津華興精細化工公司。以上試劑均為分析純。

1.1.2儀器UV2501-PC型紫外掃描儀，日本島津Shimadzu公司；BS124S型電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；BS 100S型分析天平，北京賽多利斯有限公司；ULT1386-3-V38型低溫冰箱，美國REVCO公司；DCD-172K型常規冰箱，美國伊萊克斯公司；Freeze 6型冷凍干燥機，Labconco公司；DF-101S型智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1試驗設計在采用戊二醛法(glutaraldehyde)合成恩拉霉素人工免疫抗原(圖1)的基礎上，選取影響恩拉霉素人工抗原合成偶聯率的反應物質量比例、反應溶劑比例、溫度及pH等因素，采用L9(34)正交試驗進行4因素3水平的試驗因素與水平設計(表1和表2)，以確定恩拉霉素人工抗原合成的最佳方案。其中，溶劑的比例以PBS與1,4-二氧六環的體積比表示，相同反應溫度的各處理在同一全溫培養搖床中進行反應，pH通過緩沖液PBS調節及維持。

圖1恩拉霉素人工免疫抗原合成路線

表1恩拉霉素人工免疫抗原合成的 L9 (34) 正交試驗因素與水平

注：表中mBSA、mEr分別為牛血清蛋白(BSA)和恩拉霉素(Enramycin)的質量。

Note: mBSAand mErare BSA and Enramycin mass respectively.

表2恩拉霉素人工免疫抗原合成L9(34)正交試驗方案

1.2.2恩拉霉素人工免疫抗原的制備過程取一定量的BSA于一試管中，然后根據表1中PBS與1,4-二氧六環的體積比加入相應體積的PBS溶液，等BSA完全溶解后即得試驗用溶劑。根據表2各試驗方案取相應量的恩拉霉素分別盛于錐形瓶中，將上述配制的溶劑分別加入其中后搖勻，待恩拉霉素基本溶解后，再向錐形瓶中加入相應量的1,4-二氧六環，混勻。將磁力攪拌子放入錐形瓶后將其放入一個盛有水的大燒杯中，于25℃下邊攪拌邊水浴，5 min后在保持攪拌狀態下，向反應器內逐滴加入0.25%的戊二醛溶液數5 mL，之后仍保持攪拌狀態反應4 h。經過透析，干燥后得目標物質。

1.2.3人工免疫抗原的鑒定及其偶聯率采用UV2501-PC型紫外掃描儀對Er、BSA和制備的人工免疫抗原進行紫外全波段(波長200～400 nm)掃描。當Er與BSA偶聯形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波長偏移至Er和BSA特征峰之間，則表明偶聯成功，得到免疫抗原。根據吸光度計算各處理恩拉霉素人工免疫抗原的偶聯率。

1.2.4最佳方案的選擇利用Excel 2016對正交試驗所得數據進行極差分析，根據極差的大小確定各因素對反應的影響；Ki和ki分別為因素第i水平(i=1，2，3)所在處理考查指標的總偶聯率和平均偶聯率，對Ki和ki進行比較，最大即為最優，以此確定恩拉霉素人工抗原的最佳合成工藝。

2結果與討論

2.1人工免疫抗原的紫外光譜鑒定

從圖2可知，Er標準品紫外最大吸收波長為279 nm，BSA紫外最大吸收波長為278 nm，合成物的紫外最大吸收波長偏移至Er和BSA特征峰之間，表明，Er與BSA偶聯成功，得到免疫抗原Er-BSA。

圖2恩拉霉素人工免疫抗原與BSA、Er紫外全波段掃描

2.2正交試驗

各處理恩拉霉素人工抗原合成的偶聯率為17.96～26.04，其中，處理7的偶聯率最高，為26.04，處理2其次，為25.70，處理8最低，僅17.96。從表3看出，A、B、C和D 4個因素不同水平的極差依次為0.41、0.79、5.90和2.36，表明，4個因素對偶聯率的影響依次為C>D>B>A，主要影響因素為反應物質量比和溫度，而pH和反應溶劑比例為次要影響因素。結合圖4對k值(表3)進行比較得出，恩拉霉素人工抗原合成的最佳方案為A3B1C2D2，即pH 7.7，VPBS∶V二氧六環為1∶1，mBSA∶mEr為1∶1，反應溫度為28℃。

注：表中Ki為因素A、B、C、D的第i(i=1，2，3)水平所在的試驗考查指標偶聯率之和。

Note:Kipresents the coupling rate sum ati=1, 2 and 3 level of A, B, C and D factors respectively.

圖3 Er-BSA直觀分析圖

2.3最佳方案的確定

對比分析發現，該最佳方案A3B1C2D2不在試驗設計方案中，但與其中處理7(A3B1C3D2)較接近，處理7僅有反應物質量比(C因素)未處于最好水平，但其偶聯率最高。由于確定最佳優化方案時不僅要看試驗結果，同時也要結合極差分析結果進行綜合考慮，因此，基于對重要因素反應物質量比(C因素)和溫度(D因素)首選最佳水平，對次要因素反應溶劑比例(B因素)和pH(A因素)應綜合考慮的原則，確定處理2(A1B2C2D2)為最佳方案，其Er-BSA偶聯率僅次于處理7，為25.70，居第2位，表明，篩選的最佳方案符合實際，并且節約反應物(純化后的恩拉霉素)。

3結論與討論

通過L9(34) 正交試驗方法對一步法合成恩拉霉素人工免疫抗原的反應條件進行優化，確定反應物質量比和溫度是該反應的主要影響因素，最佳反應條件為反應物質量比( mBSA∶mEr) 為1∶1，反應溫度28℃，VPBS∶V二氧六環為2∶1，pH 6.7，在此條件下，Er-BSA偶聯率為25.70。

偶聯物的結合比是指偶聯物中半抗原與載體蛋白的分子個數之比，試驗優化方案中符合實際的最佳方案為反應物質量比( mBSA∶mEr) 為1∶1，反應溫度28℃，VPBS∶V二氧六環為2∶1，pH 6.7，其Er-BSA偶聯率為25.70，僅次于反應條件為反應物質量比( mBSA∶mEr) 為2∶1，反應溫度28℃，VPBS∶V二氧六環為1∶1，pH 7.7的偶聯率(26.04)，居第2位。不同研究最佳偶聯比的結果存在差異，通常認為半抗原分子與載體蛋白的偶聯比為(5～30)∶1最佳[11]。該研究以結合比適當的偶聯物作為人工抗原，能夠獲得效價高、特異性強的以BSA為載體的偶聯物。