運用Plackett-Burnman設計和Box-Behnken-響應面法優化地榆沒食子酸提取工藝

唐遠江， 余 波， 劉 鏡， 周思璇， 張 濤， 盧昱希

(1.貴州省農業科學院 畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 550005；2.貴州宏宇畜牧技術發展有限公司，貴州 貴陽 550005)

地榆(SanguisorbaofficinalisL)是薔薇科(Rosaceae)地榆屬(SanguisorbaLinn)植物，多年生草本，高30～120 cm，中生植物[1]。地榆的花、莖葉、根分別含有多種化學成分。槲皮素、山奈素苷、熊果酸、維生素等是莖葉的主要成分；花中主要含矢車菊苷、矢車雙菊苷、楊梅苷、花青苷、無色花青苷黃酮醇以及兒茶素等；根中有鞣質(17%)和三萜皂苷(2.4%～4.0%)，還有黃酮、蒽醌、甾體類等化學成分[2]。俞浩等[3-4]研究表明，地榆中的鞣質具有止血作用。體外抑菌試驗表明，地榆能有效抑制溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草桿菌的生長[5]，地榆水提取液及醇提取液能明顯抑制正常大鼠甲醛性足腫脹，具有一定的抗炎消腫作用[6]。相比抗生素，中藥具有無殘留、不易產生耐藥性、價格便宜等優點，在畜牧養殖中的作用日趨重要[7]?！吨袊F藥典》2015版第2部中規定沒食子酸為地榆的主要成分[8]，文獻報道多采用酸水煎煮或回流提取植物中的沒食子酸[9-11]，而關于地榆沒食子酸的提取和生產報道較少，僅藍海等[12]采用醇提取紫蘇地榆沒食子酸。因此，為拓展地榆沒食子酸的提取方法，筆者等運用Plackett-Burnman(PBD)設計和Box-Behnken-響應面法(BBD)，優化建立安全、穩定的地榆沒食子酸的提取工藝，以期為該中藥的開發和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品及試劑 地榆分析樣品，購自四川千方中藥飲片有限公司，批號20110301，產地四川；沒食子酸對照品，購于中國食品藥品檢定研究院，批號110765-201308；其他試劑為色譜純或分析純。

1.1.2 儀器 LC-20型島津高效液相色譜儀，日本島津公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，成都美普達儀器有限公司；BSA224S型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；潔拓超聲波清洗儀，深圳市潔拓超聲清洗設備有限公司；DHG-9240A電熱恒溫干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；RE-5205型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；多功能提取罐，成都永泰化工機械廠；真空濃縮回收器，成都永泰化工機械廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 沒食子酸的定量檢測[8]

1) 色譜條件。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)為流動相，檢測波長為272 nm，進樣量10 μL。

2) 對照品溶液的制備。取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含 30 μg的溶液。

3) 供試品溶液的制備。取藥材粉末(過四號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加10%鹽酸溶液10 mL，加熱回流3 h，放冷，過濾，濾液置于100 mL量瓶中，用水適量分數次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得，記錄對照品和樣品的色譜圖。

4) 線性關系考察。精密稱取沒食子酸對照品12.03 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別吸取對照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、12 mL、17 mL于50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，所得對照品濃度分別為4.82 μg/mL、9.64 μg/mL、19.28 μg/mL、38.56 μg/mL、57.84 μg/mL、81.94 μg/mL，分別取各濃度標準品溶液10 μL進樣，記錄色譜圖峰面積。以峰面積值Y對對照品濃度X進行回歸，繪制標準曲線方程。

5) 精密度試驗。精密吸取沒食子酸對照品溶液(19.28 μg/mL)10 μL，按上述色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積，計算峰面積的相對標準偏差(RSD)。

6) 穩定性試驗。取地榆藥材，制備供試品溶液。取供試品溶液，于制備后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h分別進樣，每次進樣量10 μL，計算峰面積的RSD。

7) 重現性試驗。取地榆藥材6份，制備樣品供試品溶液，取供試品溶液進樣10 μL，計算沒食子酸含量。

8) 加樣回收試驗。取已知含量(3.14 mg/g)的樣品0.5 g，共6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入沒食子酸對照品溶液(0.24 mg/mL)5 mL，制備供試品溶液，進行測定，以供試品溶液中絕對質量分數計算加樣回收率。

1.3 PBD篩選主要因素

取10 g地榆采用水浴加熱進行提取，旋轉蒸發儀進行濃縮，濾液濃縮至相對密度為1.35～1.40(70℃)的浸膏。運用Designexpert 10.3.2進行PBD試驗，考察各個因素對出膏率和沒食子酸提取量的影響。根據中藥材中試提取經驗，試驗對A(浸泡時間)、B(乙醇體積分數)、C(溶劑量)、D(溫度)、E(提取時間)、F(提取次數)等6個主要因素進行評價，根據預試驗結果確定每個因素高(代碼：1)、低(代碼：-1)2個水平共12組試驗，篩選對出膏率和沒食子酸提取量的主要影響因子。PBD試驗因素和水平見表1。

1.4 BBD 試驗優化提取工藝

取10 g地榆采用水浴加熱進行提取，旋轉蒸發儀進行濃縮，濾液濃縮至相對密度為1.35～1.40(70℃)的浸膏。根據PBD試驗結果，以出膏率(y1)和沒食子酸含量(y2)為目標響應值，選取提取次數(x1)、提取時間(x2)和溶劑量(x3)設計3因素3水平的響應面分析試驗，響應因素水平見表2。采用多指標數據處理“歸一值(OD)”[13]對出膏率和沒食子酸含量進行數據處理，OD=(d1d2d3……dn)1/n，n為指數，取值越小越好的指標di=(ymax-yi)/(ymax-ymin)，取值越大越好的指標di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，i=1，2，3……n，n 為指標數。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸定量檢測試驗的可靠性

線性關系試驗得出標準曲線方程為：y= 255 79x-19 089，R2= 0.999 2，進樣濃度在4.82～81.94 μg/mL，表明進樣濃度和峰面積線性關系良好。沒食子酸對照樣品和檢測樣品的HPLC色譜圖見圖1。精密度試驗得出對照樣品RSD<2%，說明儀器精密性良好。穩定性試驗表明，沒食子酸色譜峰面積RSD值為1.03%，樣品供試液在12 h內穩定性良好。重現性試驗得出，地榆樣品平均含量為1.52 mg/g，RSD<2%，表明該樣品處理方法重現性好。加樣回收試驗表明，沒食子酸平均回收率為99.81%，RSD為0.61%，說明方法可靠，準確度好，符合含量測定的要求。

2.2 影響地榆提取工藝的主要因素

按照PBD試驗設計，得到各處理的出膏率和沒食子酸提取量(表3)。顯著性分析結果(表4)表明，溶劑量、提取次數、提取時間對沒食子酸提取量的影響達顯著水平，浸泡時間、溫度、乙醇體積分數的影響不顯著；6個試驗因子中除提取次數外其余因子對出膏率的影響程度均不顯著。因此，溶劑量、提取次數、提取時間是沒食子酸提取量和出膏率的主要影響因子，故以溶劑量、提取次數和提取時間進行Box-Behnken試驗設計。

表3 PBD試驗不同因子與水平下地榆的出膏率和沒食子酸提取量

表4 PBD試驗各因素對出膏率和沒食子酸提取量的影響顯著性(P值)

注：* *和*分別表示影響程度達極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)水平。

Note:* *and*indicate significant difference at 1% and 5% levels respectively.

2.3 提取工藝回歸模型的建立

根據BBD試驗設計，得到溶劑量、提取次數、提取時間不同水平條件的出膏率、沒食子酸提取量和OD值(表5)。以OD值為響應值分別對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合，得到OD值對提取次數x1、提取時間x2和溶劑量x3的二次多項回歸方程：OD=-5.21+1.54x1+1.08x2+0.11x3+0.01x1x2+0.02x1x3+0.01x2x3-0.46x12-0.08x22-0.01x32。模型F=24.16，P<0.001，響應回歸模型極顯著；失擬項P>0.05，失擬不顯著，說明該回歸模型擬合程度較好[14]。

2.4 地榆沒食子酸最佳提取工藝的建立

以x1、x2、x3中任意一個變量固定，其余2個變量對OD值作響應面圖。從圖2看出，x2和x3對OD值的交互作用不顯著，x1和x2對OD值有一定影響，x1和x3對OD值的交互作用明顯[15]。根據回歸模型，得到地榆的最佳提取工藝為：加33.5倍水，90℃下回流提取2次，每次4.2 h，預測值y1=16.24%，y2=4.25 mg/g。

表5 BBD試驗不同處理的出膏率和沒食子酸提取量

2.5 最佳提取工藝的驗證

取地榆根適量，加33.5倍水， 90℃下回流提取4.2 h，提取2次，按此工藝參數進行3次平行試驗，得到平均出膏率為16.27%，沒食子酸平均提取量為4.21 mg/g(表6)。沒食子酸提取量和出膏率與預測值相近，說明建立的回歸模型較好，獲得的地榆沒食子酸提取最佳工藝具有良好的可信度。

2.6 最佳工藝在生產試驗中的應用效果

分別采用原工藝和最佳工藝對5組地榆商品進行擴大化生產試驗(20140621、20140526原工藝，20151101、20151102和20151103最佳工藝)，生產試驗每組地榆按50 kg進行擴大，配套相應工藝參數，采用多功能提取罐進行提取、真空濃縮回收器濃縮，得到擴大生產后的2種工藝條件下沒食子酸轉移率和出膏率(表7)。相比于原工藝，最佳工藝的出膏率提高51.0%，沒食子酸轉移率提高105.8%，均有顯著提高。因此，最佳工藝可以應用于實際生產。

表6 地榆沒食子酸最佳提取工藝驗證試驗結果

表7 地榆沒食子酸最佳提取工藝在生產試驗中的出膏率和沒食子酸提取量

3 結論與討論

通過Plackett-Burnman設計和Box-Behnken-響應面法優化地榆沒食子酸的提取工藝，得到地榆沒食子酸的最佳提取工藝為加33.5倍水，90℃下回流提取2次，每次4.2 h。與原工藝提取比較，應用該工藝對地榆進行提取，其出膏率提高51.0%，沒食子酸轉移率提高105.8%，提取效果好。

在中藥有效成分提取中需考慮到多個單因素試驗以及試驗次數較多的正交設計，工作費時費力且具有盲目性，因此，本試驗引用全新設計，為提取工藝的研究與提取率的提高提供新的思路和方法。PBD是一種近飽和的兩水平篩選試驗設計方法，通過比較各因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性，能用最少的試驗次數快速有效地篩選出顯著影響因子[16]。BBD-響應面法具有結果直觀、預測性好的優點，試驗預測值能更好的考察參數合理性和試驗設計的準確性[17]。本研究通過驗證試驗，其驗證結果大于預測值，說明PBD聯合BBD-響應面法在中藥提取中具有良好的可行性。

PBD試驗中發現，高濃度乙醇不利于沒食子酸的提取，與藍海等[12]用醇提沒食子酸的最佳工藝相悖，劉麗艷[18]用酸或堿水解得到鞣質，通過乙酸乙酯萃取得到沒食子酸的粗提液，但在工業生產中生產成本高昂，不可能采用醇、酸或堿提取。藥材在生產試驗提取過程中，干膏率和沒食子酸提取量均有所下降，所以在提取過程中應盡量將藥材分裝到較大的袋中，增大藥材與水的接觸面積，減少藥渣與水混合，同時避免粉碎后投料易堵塞過濾網而造成過濾困難。由于工藝采用水提取，試驗中得出高溫有利于沒食子酸提取，但并未對提取溫度進行優化，后續試驗應該對工藝參數進行更加細化。