錯配修復/微衛星不穩定性對晚期結直腸癌化療敏感性及預后的影響

王麗 毛海燕 童建東 汪竹

[摘要] 目的 探究錯配修復/微衛星不穩定性（MSI）在晚期結直腸癌化療敏感性及臨床轉歸中的意義。 方法 收集2009年12月～2016年12月在揚州大學附屬醫院腫瘤科的接受FOLFOX或XELOX一線方案化療的181例晚期結直腸癌患者的原發腫瘤組織，采用免疫組化方法檢測腫瘤組織MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 4種蛋白的表達情況，并分為MSI組（18例）和微衛星穩定組（MSS組，163例），比較兩組在化療敏感性和預后中的差異。 結果 除了病變部位外（P < 0.05），其他臨床特征在MSI組及MSS組中差異均無統計學意義（P > 0.05）。采用Kaplan-Meier生存曲線對隨訪資料進行分析，MSI組和MSS組的患者總體生存時間差異無統計學意義（P > 0.05）。化療敏感性方面，MSI組和MSS組的化療總有效率差異無統計學意義（P > 0.05），但是MSI組疾病控制率顯著高于MSS組，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 MSI狀態與晚期結直腸癌患者的總生存時間無關，與疾病控制率有關。因此，MSI可以作為評估晚期結直腸癌患者化療效果的重要指標。

[關鍵詞] 錯配修復/微衛星不穩定性;結直腸癌;化療敏感性;預后

[中圖分類號] R735.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0108-05

結直腸癌是人類常見的惡性腫瘤，近年來其發病率和死亡率在世界范圍內顯著升高[1]。我國也不例外，結直腸癌的發病率增幅遠超其他消化道惡性腫瘤[2]。目前，結直腸癌臨床治療主要包括手術治療、化學治療及放射治療。其中，手術治療是最主要的治療手段，但是術后仍有近一半的患者發生局部復發或者遠處轉移。錯配修復（mismatch repair，MMR）基因是修復DNA雙螺旋結構錯誤過程中的關鍵基因，其缺失狀態稱為dMMR（mismatch repair defective），而無缺失狀態稱為pMMR（mismatch repair proficient）[3]。MMR缺陷可導致DNA復制后自我修復功能喪失，產生微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI），而沒有位點發生微衛星不穩定現象則稱為微衛星穩定（microsatellite stability，MSS）。目前認為，MMR基因主要包括MSH2、MLH1、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2，任何一項錯配修復基因表達缺失都可以導致MSI[4]。由于MSI在結直腸癌發生發展過程中發揮著重要作用，許多學者對其臨床意義進行相關研究，但是仍存在較大分歧[5-6]。為此，本研究回顧性分析181例晚期結直腸癌患者MMR/MSI狀態對患者生存和化療敏感性的影響，進一步明確其在判斷預后及化療效果中的實際價值，為其更精準地應用于臨床提供重要理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年12月～2016年12月于揚州大學附屬醫院腫瘤科接受治療的晚期結直腸癌患者181例。納入標準：①所有患者均經病理確診為結直腸癌，且隨訪資料完整;②年齡18～70歲;③影像學檢查或轉移灶活檢明確存在遠處轉移灶;④ECOG 0～1分或PS評分>70分;⑤有RECIST實體瘤療效評價標準中的可測量病灶;⑥至少完成2個周期FOLFOX或XELOX方案化療，并有療效評估結果。排除標準：①病理診斷不明確;②存在化療禁忌證;③預計生存期 < 3個月;④患者依從性差;⑤嚴重心肺器質性疾病及造血系統疾病。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者和/或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 化療方案

FOLFOX方案：奧沙利鉑85 mg/m2靜脈滴注2 h，第1天;亞葉酸鈣200 mg/m2靜脈滴注2 h，第1～2天;5-氟尿嘧啶400 mg/m2靜脈推注，第1～2天，接著給予5-氟尿嘧啶600 mg/m2持續靜脈注射22 h，第1～2天。化療方案每2周重復1次。

XELOX方案：奧沙利鉑130 mg/m2靜脈滴注2 h，第1天;卡培他濱850～1000 mg/m2口服每天2次，第1～14天。化療方案每3周重復1次。

1.3 化療療效判斷

根據RECIST實體瘤療效評價標準判斷完全緩解（complete remission，CR），部分緩解（partial remission，PR），穩定（stable disease，SD），進展（progressive disease，PD），CR+PR定義為為治療有效，CR+PR+SD定義為疾病控制。總生存時間（overall survival，OS）定義為從確診為晚期結直腸癌至任何原因導致的死亡的時間。

1.4 實驗方法

1.4.1 主要實驗試劑和實驗儀器? 小鼠抗人MLH-1單克隆抗體（生產批號：18386503）、兔抗人MSH-2單克隆抗體（生產批號：18660703）、兔抗人MSH-6單克隆抗體（生產批號：18680403）、兔抗人PMS-2單克隆抗體（生產批號：18610203）及二步法通用試劑盒（小鼠/兔超敏聚合物法檢測系統）（生產批號：110167D12）均購自中國中杉金橋生物技術有限公司，組織包埋機及石蠟切片機購自美國賽默飛世爾科技有限公司，全自動組織脫水機購自英國珊頓公司，染片機、漂片機及免疫組化觀察顯微鏡購自法國萊卡公司。

1.4.2免疫組織化學方法? 腫瘤組織依次經過甲醛固定、洗滌與脫水、透明、浸蠟、包埋及切片。厚度為4～5 μm的切片經梯度酒精脫水、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶及血清封閉。切片經PBS水洗3次，按工作濃度滴加一抗后4°C孵育過夜。PBS水洗切片3次;按工作濃度滴加二抗，室溫孵育50 min。切片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌后滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，蘇木精復染3 min，梯度酒精脫水和中性樹膠封片。

結果判讀：所有閱片均由兩名具有豐富臨床經驗的病理科醫師完成。染色結果判讀依據如下：隨機選取5個高倍鏡視野進行觀察，根據染色強度和染色面積進行評分。染色強度分為：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色面積分為：0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為>10%～50%，3分為>50%～75%，4分為>75%。將上述兩者相乘的結果作為最終的評定標準：0分為陰性表達，1～3分為弱陽性表達，4～7分為中度陽性表達，8～12分為強陽性表達。4種蛋白中任意一種表達為陰性則定義為MSI狀態。

1.5 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 17.0對數據進行分析，計數資料用率表示，采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier生存模型構建生存曲線，兩組生存曲線比較則采用時序檢驗（Log-rank test）。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般臨床特征

本研究共納入181例晚期結直腸癌患者，其中男96例，女85例;<60歲76例，≥60歲105例;腫瘤低分化者68例，中高度分化者113例;病變部位在右半（包括升結腸、橫結腸、肝曲）者86例;左半（包括直腸、乙狀結腸、降結腸、脾曲）者95例;單發轉移者11例，多發轉移者170例。除了病變部位外，其他臨床特征在MSI組和MSS組差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 兩組錯配修復蛋白的表達情況

免疫組織化學結果顯示在181例晚期結直腸癌患者的原發腫瘤組織中，18例（9.9%）判定為dMMR，即MSI;163例（90.1%）判定為dMMR，即MSS。

2.3 MSI對晚期結直腸癌患者預后的影響

Kaplan-Meier生存分析結果顯示，MSI組和MSS組患者的總生存時間分布差異無統計學意義（P > 0.05）。

2.4 患者化療效果的分析

所有晚期結直腸癌患者接受FOLFOX或XELOX方案化療。MSI組中，2例部分緩解，10例穩定，6例進展，化療總有效率為11.1%，疾病控制率為66.7%;MSS組中，14例部分緩解，54例穩定，95例進展，化療總有效率為8.6%，疾病控制率為41.7%，兩組總有效率無統計學差異，但MSI組疾病控制率顯著高于MSS組。此外，本研究中沒有患者出現完全緩解。MSI組和MSS組的化療總有效率差異無統計學意義（P > 0.05），但是MSI組疾病控制率顯著高于MSS組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

微衛星又稱短串聯重復（short tandem repeat，STR）序列，是DNA基因組中小于10個核苷酸的簡單重復序列，其隨機分布于人類基因組的編碼區和非編碼區，其中位于編碼區的微衛星容易出現復制滑脫[7-8]。正常生理條件下，DNA錯配修復系統可以及時發現并糾正微衛星序列復制產生的錯誤，進而維持整個基因組的穩定;而當出現基因突變或缺失時，DNA錯配修復系統不能正常修復DNA復制過程中滑動鏈與互補堿基出現的錯配，導致一個或多個重復堿基的插入或缺失，進而引起MSI[9]。

目前主要利用兩種方法檢測MSI：一是通過聚合酶鏈反應檢測樣本中微衛星位點序列，并與正常DNA序列進行比對分析，進而判別MSI狀態;二是通過免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）檢測樣本中錯配修復蛋白表達情況。既往結直腸癌相關研究將錯配修復缺陷定義為錯配修復蛋白缺失，即MSI-H，而錯配修復蛋白表達完整定義為MSI-L或MSS[10-11]。IHC檢測法相比于聚合酶鏈反應有著易操作、成本低等優勢，且能夠靶向識別特定蛋白缺失，因而在臨床上普遍用于檢測結直腸癌組織MSI[12]。本研究也采用了該方法檢測晚期結直腸癌患者腫瘤組織中MSI狀態。

目前，MLH-1和MSH-2為早期發現的錯配修復蛋白，在結直腸癌中研究較為透徹[13-17]。此外，MLH1蛋白可以與PMS2或MSH2蛋白相形成二聚體，進而參與調控核酸內切酶活性。類似的，MSH2蛋白可與MSH6蛋白形成復合蛋白進而參與調控錯配修復[18-19]。本研究中檢測晚期結直腸癌患者腫瘤組織中四種代表性錯配修復蛋白（MLH-1、MSH-2、MSH6以及PMS2）的表達情況，結果發現有18例（9.9%）患者存在MSI。同時，本研究還發現MSI狀態與腫瘤位置顯著相關，而與其他臨床病理參數（如年齡、性別、病理類型以及腫瘤組織分化程度）無關（P > 0.05）。上述發現與國內學者李政[20]研究一致，他們發現基因編碼差異以及蛋白表達水平不同可能與結直腸癌的發病位置存在關聯。在預后分析中，本研究發現MSI狀態與晚期結直腸癌患者的總體生存無顯著相關性。Des Guetz等[21]通過Meta分析也得出了MSI對晚期結直腸癌患者總生存時間及化療反應無影響的結論。國內學者吳雨辰等[22]在其最新研究中也驗證了上述結論。最后，本研究在分析MSI狀態對一線化療方案（FOLFOX或XELOX）治療效果的影響時發現其與化療總有效率無關（P > 0.05），但MSI組疾病控制率顯著高于MSS組（P < 0.05），提示MSI患者較MSS患者在接受一線化療后存在較低的腫瘤進展風險。

盡管本研究初步明確了MSI對晚期結直腸癌患者預后及化療效果的影響，但仍存在一定的局限性。首先，研究結果來自于單中心臨床隊列，具有一定的選擇偏倚;其次，本研究主要關注于MLH-1、MSH-2、MSH6以及PMS2 4種蛋白，而其他錯配修復蛋白（如MSH3和PMS1）是否在晚期結直癌患者中具有一定的臨床意義尚未清楚。再次，由于MSI患者在總體患者中所占比例較低（18例），導致研究樣本量較小，因而MSI在晚期結直腸癌中的臨床預后價值仍需進一步在多中心大樣本的臨床研究中得以驗證。最后，本研究僅限于檢測錯配修復蛋白在臨床樣本中的表達水平，后續我們將進行體內體外功能研究，進一步闡明相關分子機制。

綜上所述，本研究發現MSI與晚期結直腸癌化療敏感性密切相關，盡管這樣的結果還有待在大樣本人群中進行驗證。除此之外，聯合環境相關的因素，例如飲食因素與MSI在結直腸癌發生發展是否存在協同作用值得深入研究。隨著相關研究的深入，MSI有望成為臨床重要的診斷及預后指標，幫助廣大結直腸癌患者改善預后，最終提高結直癌的總體生存率。

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（收稿日期：2018-07-16? 本文編輯：蘇? ?暢）