EB病毒感染患兒免疫細胞功能變化及其臨床意義

劉雪凱 王迎時 辛勤 高雨菡

[摘要] 目的 研究兒童EB病毒（EBV）感染引起外周血淋巴細胞亞群及T淋巴細胞功能的變化，并探討血清EBV DNA載量與淋巴細胞亞群變化的關系。 方法 選取航天中心醫院（以下簡稱“我院”）2015年1月～2018年7月收治的25例EBV感染患兒作為感染組;另選我院同期體檢的25名健康者作為對照組。采用流式細胞術檢測外周血中淋巴細胞亞群及CD8+ T淋巴細胞穿孔素和顆粒酶B的表達情況。采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測外周血單個核細胞（PBMC）分泌γ干擾素（IFN-γ）和白細胞介素4（IL-4）水平。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（FQ-PCR）技術檢測血清EBV DNA載量。 結果 感染組外周血CD3+、CD8+細胞比值及絕對值明顯高于對照組（P < 0.001），CD4+細胞比值顯著低于對照組（P < 0.001），但兩組細胞絕對值間差異無統計學意義（P > 0.05），而感染組CD4/CD8比值顯著低于對照組（P < 0.001），但其比例變化與患兒血清EBV DNA載量不存在線性相關（r = 0.19，P > 0.05）。CD19+細胞比值及絕對值均低于對照組（P < 0.001）。兩組CD16+CD56+NK細胞比值及絕對值差異無統計學意義（P > 0.05）。與對照組比較，感染組PBMC的IFN-γ分泌增多（P < 0.01），IL-4分泌減少（P < 0.05）;CD8+ T細胞穿孔素和顆粒酶B分泌顯著增加（P < 0.05）。 結論 感染組外周血中淋巴細胞亞群及其功能有明顯變化，檢測其變化規律對了解患兒細胞免疫功能狀況及指導臨床治療有重要意義。

[關鍵詞] EB病毒;淋巴細胞亞群;γ干擾素;白細胞介素4;穿孔素

[中圖分類號] R725.1;R440? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0072-05

EB病毒（EBV）為雙鏈DNA病毒，其感染多發生于兒童時期，可累及全身多個器官，與多種疾病的發生有密切聯系，如傳染性單核細胞增多癥、淋巴瘤等[1-3]。EBV主要侵犯B淋巴細胞，并且能在感染后引起強烈的細胞免疫反應，患者往往出現免疫細胞特別是淋巴細胞比例及多種細胞因子水平異常[4-6]。機體免疫水平及其對EBV的免疫應答狀態與感染后不同臨床表現及疾病預后有密切關系。既往研究多關注于淋巴細胞亞群的改變，其對淋巴細胞功能的研究并不深入。

本研究通過檢測EBV感染兒童外周血淋巴細胞亞群及其功能變化以及其與EBV DNA載量的關系，以揭示EBV對兒童免疫功能的影響，深化對該病發病機制的認識，為臨床檢測及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取航天中心醫院（以下簡稱“我院”）2015年1月～2018年7月收治的EBV感染兒童25例作為感染組。納入標準：①符合《兒童EB病毒相關疾病的診斷標準和治療原則》[7]的診斷標準;②EBV DNA>1×103拷貝/mL，患兒血清EBV衣殼抗原IgM檢測呈陽性;③患兒家屬自愿參與本研究，并簽署知情同意書。排除標準：①合并心肌炎、肝炎、溶血性貧血及血小板減少的危急病情;②入院前有相關免疫調節治療。感染組男14例，女11例;年齡1～12歲，平均（4.5±0.6）歲。另取我院同期體檢健康者25名為對照組，男15名，女10名;年齡1～12歲，平均（5.3±0.8）歲;體檢者近期均無感染及傳染病癥狀。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑

BriCyte E6流式細胞儀及原裝配套抗體、溶血劑和質控物（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）;ABI 7500實時熒光定量PCR分析儀（Thermo Fisher），相關檢測試劑（生產批號：p1101706004）購于天隆科技公司;抗體包括T淋巴細胞抗體試劑：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-perCP/CD4-APC;B淋巴細胞抗體試劑：CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC（批號：2017040100）、γ干擾素（IFN-γ）和白細胞介素4（IL-4） ELISA試劑盒購（生產批號：20141026）購自美國R&D公司;Anti-human perforin（生產批號：563762）、Anti-human granzyme B（生產批號：560211）、Anti-human CD8（生產批號：561952）、IC Fixation Buffer、10×Permeabilization Buffer（生產批號：554715）購于美國BD公司。

1.3 淋巴細胞亞群檢測

采用全血免洗法，即上機后流式細胞儀自動設門檢測CD3+T細胞、CD4+T細胞（CD3+CD4+）、CD8+T細胞（CD3+CD8+）、B淋巴細胞（CD19+）和自然殺傷（NK）細胞（CD3-CD16+56+）占淋巴細胞總數的百分比及其絕對值，絕對值測量方法為體積法。CD3+/CD4+比值為計算值。

1.4 IFN-γ、IL-4檢測

采用密度梯度離心法分離單個核細胞（PBMC），調整細胞濃度為1×106/mL，加入24孔板中，ConA（50 μg/mL）刺激48 h后收集上清，按照各自說明書檢測。

1.5 穿孔素及顆粒酶B的檢測

受試者外周肝素抗凝靜脈血裂解紅細胞后，加入Anti-human CD8避光染色30 min，洗滌離心，細胞加入固定劑和通透劑，洗滌離心，加入Anti-human perforin、Anti-human granzyme B避光染色30 min后上機檢測。

1.6 EBV DNA定量檢測

采用實時熒光定量PCR技術檢測EBV DNA的載量。EDTA抗凝全血3 mL，3000 r/min離心10 min，取50 μL血漿，加入50 μL核酸提取液，振蕩混勻15 s，干浴10 min后，以12.5 cm的離心半徑1500 r/min離心10 min，取上清液供實時熒光定量PCR使用。

1.7 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血淋巴細胞亞群比值比較

感染組CD3+、CD8+細胞比例（CD3+：86.05±1.17;CD8+：65.52±1.88）明顯高于對照組（CD3+：68.08±1.85;CD8+：19.39±1.66），差異有高度統計學意義（P < 0.001），且其CD4+、CD4/CD8比值（CD4+：14.35±0.96;CD4/CD8：0.23±0.02）顯著低于對照組（CD4+：43.35±1.28;CD4/CD8：2.43±0.23），差異有高度統計學意義（P < 0.001）。感染組CD19+細胞比例（5.06±0.66）低于對照組（20.62±0.99），差異有高度統計學意義（P < 0.001）。兩組CD16+CD56+NK細胞比例差異無統計學意義（感染組：10.52±1.71;對照組：7.44±0.64，P > 0.05）。

2.2 兩組外周血淋巴細胞亞群絕對值比較

計數單位體積內淋巴細胞數目（單位：個/μL），感染組CD3+、CD8+細胞數目（CD3+：13030±1518;CD8+：9910±1167）。明顯高于對照組（CD3+：3948±374;CD8+：1122±134），差異有高度統計學意義（P < 0.001）。感染組CD19+細胞數目（595±74）低于對照組（1220±141），差異有高度統計學意義（P < 0.001）。兩組間CD4+T淋巴細胞[CD4+T淋巴細胞：感染組（2057±247）、對照組（2525±265）]及CD16+CD56+NK細胞數目[CD16+CD56+NK細胞：感染組（1120±207）、對照組（653±132）]比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。

2.3 兩組CD4+T細胞功能比較

與對照組比較，感染組IFN-γ分泌顯著增加[感染組：（90.79±13.83）ng/mL;對照組：（57.05±8.72）ng/mL，P < 0.01]，而IL-4分泌減少[感染組：（63.94±18.67）ng/mL;對照組：（117.78±25.56）ng/mL，P < 0.05]。

2.4 兩組CD8+T細胞功能比較

與對照組比較，感染組CD8+T細胞穿孔素及顆粒酶B陽性細胞百分比均較對照組有顯著增加[CD8+T細胞穿孔素百分比：感染組（31.82±9.48）%、對照組（13.57±5.27）%，P < 0.01;顆粒酶B陽性細胞百分比：感染組（48.36±15.75）%、對照組（27.04±7.81）%，P< 0.05）]。

2.5 感染組CD4/CD8比值與EB DNA載量關系

感染組EBV DNA載量與淋巴細胞亞群CD4/CD8比值變化無相關性（r = 0.19，P > 0.05）。

3 討論

EBV感染患兒的臨床表現具有潛伏性，多樣性，可累及多個器官系統，并與一些惡性病變、腫瘤及自身免疫病等密切相關[8]。EBV的靶細胞是B淋巴細胞，病毒外膜蛋白gp350/P220與B淋巴細胞表面受體CD21結合后進入B淋巴細胞，不斷復制，繼而引起T淋巴細胞大量活化擴增[9-13]。本研究結果顯示，EBV感染患兒存在明顯的細胞免疫異常，主要表現在免疫細胞比例失衡與功能改變。與對照組比較，感染組CD19+ B細胞明顯減少，這主要是與靶細胞被大量殺傷有關;CD3+ T細胞比例和數目增加，其中CD8+ T細胞的改變尤為顯著，提示機體細胞免疫激活，T淋巴細胞大量增殖，CD4/CD8比例明顯降低。感染組CD16+CD56+ NK細胞絕對值略有升高，但兩組差異無統計學意義（P > 0.05），這可能與樣本量少有關。

Th1/Th2細胞亞群是CD4+ T淋巴細胞的兩種主要效應細胞類型，其在細胞免疫發揮重要作用[14-16]。其中Th1細胞主要分泌細胞因子IFN-γ，介導細胞免疫應答，Th2細胞主要分泌細胞因子IL-4，促進變態反應。本研究結果顯示，感染組外周血中PBMC的IFN-γ分泌增加而IL-4分泌減少，提示EBV感染后機體通過增加IFN-γ的分泌上調細胞免疫應答，達到清除病毒的目的。CD8+ T細胞是殺傷靶細胞、參與細胞免疫應答的主力效應細胞，其識別靶細胞后可通過分泌穿孔素在靶細胞膜上打孔，導致細胞滲透壓改變，同時顆粒酶B進入細胞引起DNA裂解，細胞死亡[17-19]。本研究顯示，EBV感染后CD8+ T淋巴細胞被激活，上調穿孔素及顆粒酶B的表達，殺傷靶細胞，從而達到清除病毒的目的。

實時熒光定量PCR檢測EBV DNA是診斷EBV的金指標[20]。通過定量檢測機體EBV DNA拷貝數，反映EBV感染和病毒復制情況，并且EBV DNA載量與病情嚴重程度及預后密切相關[21-23]。本研究發現，EBV感染后，機體CD4/CD8比例會減小甚至倒置，但并不能通過CD4/CD8比例變化程度推測體內EBV DNA拷貝數的多少。

綜上所述，EBV感染患兒體內淋巴細胞穩態失衡，細胞免疫應答功能增強。臨床對EBV感染兒童除采取積極抗感染措施外，還應密切監視患兒機體免疫情況，尤其是合并免疫功能低下及重癥患者，應適當使用免疫調節劑，促進其機體細胞免疫應答，加速機體對EBV的清除，促進患兒康復。

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（收稿日期：2018-11-26? 本文編輯：王? ?蕾）