小麥乙烯合成通路關鍵基因TaACS2在抗赤霉病中的功能分析

柯裴蓓，劉 玉，張 婷，孫宇欣，何立強，肖 進，王秀娥*

(1 南京農業大學細胞遺傳研究所，作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，江蘇省現代作物生產協同創新中心，南京 210095；2 江蘇沿江地區農業科學研究所，南通 226541)

小麥赤霉病(Fusariumhead blight，FHB)亦稱麥穗枯、穗枯病、爛麥頭、紅麥頭，是小麥的重要病害之一，主要發生在溫暖潮濕和半潮濕地區[1]，是一種由亞洲鐮刀菌(Fusariumasiaticum)和禾谷鐮刀菌(F.graminearium)引起的世界性流行真菌病害。其中，禾谷鐮刀菌為半活體寄生型病原菌，在侵染植物的早期為活體營養階段，需要寄生于活體組織，后期為腐生營養階段，不需活體組織[2]，從活體寄生到腐生的轉換約在侵染后48h[3]。小麥赤霉病可以引起穗腐、莖腐、苗腐和稈腐，其中穗腐帶來的損失最大。感病麥粒的粗蛋白含量低，面粉濕面筋含量少，種用和工業價值降低；感病的麥粒中還含有多種真菌毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)毒素，可以引起人和動物中毒[4]。近年來，小麥赤霉病呈加重發生趨勢[5]。

乙烯是一種結構簡單的植物激素，在植物生長發育過程中起著重要作用[6-7]。植物體對于乙烯信號途徑的調節一般通過調節乙烯的合成來進行，乙烯合成途徑已在擬南芥中研究得較為清楚[8-9]。乙烯合成途徑中1-氨基環丙烷-1-羧酸(l-aminocyclopropane-1-carboxlic acid，ACC)合成酶(ACC synthase，ACS)催化S-腺苷蛋氨酸向ACC轉化，合成最重要的代謝中間體ACC，是關鍵的限速步驟。因此，ACS被認為是ACC和乙烯生物合成的限速酶。有研究表明，單個ACS基因的突變，可能會對整個ACS基因家族的表達水平產生影響[10]。

目前的研究表明，植物受病原菌侵染后，植物體內的乙烯釋放量明顯增加，由此判斷乙烯在植物抗病反應過程中發揮著重要作用[11]。Arnaud等[12]研究指出，乙烯是植物防御反應的報警信號，促使寄主植物產生防御反應，同時，乙烯本身也參與到防御反應中。Li等[13]研究發現，抗病品種‘蘇麥3號’接種赤霉菌后，乙烯信號途徑關鍵基因1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase，ACO)基因上調表達；外施乙烯利可提高感病小麥品種‘Y1193-6’的赤霉病抗性，認為乙烯信號通路能提高小麥對赤霉病的抗性。Gottwald等[14]利用基因芯片技術分析抗病品種‘Dream’和感病品種‘Lynx’接種赤霉菌32h和72h后的表達譜差異，發現增加乙烯信號產物可以提高赤霉病抗性。Gillespie等[15]利用表達譜分析發現，在禾谷鐮刀菌接種6h后，乙烯信號的增強與赤霉病抗性提高呈正相關。

病毒誘導基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)是通過攜帶目的基因片段的病毒侵染植物，誘導植物內源基因沉默，從而引起植物表型變化[16]。與傳統的植物基因功能研究方法相比，VIGS技術周期短、不需要遺傳轉化，且具有快速、高效、高通量等優點[17-20]。目前，VIGS技術已經作為反向遺傳學新技術應用于多種植物，如煙草、擬南芥大麥、小麥、水稻等的抗病抗逆、生長發育以及代謝調控等相關基因的功能研究中[21-26]。

本試驗以抗赤霉病小麥品種‘望水白’和‘蘇麥3號’以及來源于墨西哥的感赤霉病品種‘Alondra’s’為研究材料，克隆乙烯合成通路的關鍵基因TaACS2，對其進行序列分析和結構分析，并利用VIGS技術探究該基因與小麥抗赤霉病的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥地方品種‘望水白’：來自江蘇溧陽，高抗赤霉病；小麥品種‘蘇麥3號’：由阿夫(原產于阿爾巴尼亞)和臺灣小麥雜交育成，高抗赤霉病，是公認的抗性最好的赤霉病抗源材料；‘Alondra’s’：來源于墨西哥，高感赤霉病；赤霉菌菌株Fg0609，由江蘇省農業科學院生物技術研究所張旭研究員提供。

1.2 序列分析

1.3 小麥乙烯合成關鍵基因TaACS2的克隆

在URGI公布的小麥品種‘中國春’的基因信息中進行比對，得到TaACS2 基因在小麥中的序列全長(GenBank：AAB18416.1)。根據搜索到的序列信息設計克隆引物(表1)，在抗赤霉病材料‘望水白’中克隆獲得TaACS2 基因全長(GenBank：MK432607)。

表1 引物信息

1.4 實時熒光定量qRT-PCR

反轉錄試劑盒HiScriptII QRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)R223-01購于南京諾唯贊公司。cDNA稀釋10—20倍后作為qRT-PCR的模板使用。用南京諾唯贊公司的AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix試劑進行qRT-PCR試驗，以微管蛋白基因Tubulin作為內參基因分析基因的表達情況。試驗在RochePCR480實時熒光定量PCR儀上進行。一次平行試驗3個重復，3次生物學重復。

1.5 大麥條斑花葉病毒誘導的基因沉默

參照Wang等[27]方法進行大麥條斑花葉病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)誘導的基因沉默(VIGS)試驗。BSMV是大麥病毒家族的一個成員，它是包含有α、β、γ 3個部分基因組的RNA病毒。目前BSMV載體最常用的主要是利用修飾過的γ作為重組的載體[28]。VIGS試驗中，以接種BSMV(α、β、γ病毒載體)的植株作為對照，若侵染成功，接種BSMV：PDS(α、β、γ-PDS病毒載體)的植株會出現葉片漂白失綠現象。

根據已經克隆到的候選基因序列，選擇相對保守的區段設計引物構建載體(表1)。克隆TaACS2基因的特異序列，用T4 DNA連接酶與γ載體片段連接，最終獲得正確的質粒載體γ-TaACS2，對載體進行線性化處理，利用體外轉錄試劑盒對線性化產物進行體外轉錄。

將α、β病毒載體的體外轉錄產物分別和γ、γ-PDS、γ-TaACS2的體外轉錄產物混合，從小麥基部第一個小穗開始進行涂抹至旗葉頂端。接種大麥條斑花葉病毒后8—10d，對接種BSMV(α、β、γ病毒載體，對照)、BSMV：PDS(α、β、γ-PDS病毒載體)、BSMV：TaACS2(α、β、γ-TaACS2病毒載體)的植株形態進行觀察，并對赤霉菌接種點取樣，提取RNA，進行目的基因表達分析，檢測基因沉默效率。

1.6 赤霉菌的接種及抗赤霉病鑒定

在接種大麥條斑花葉病毒后在小麥植株揚花期時，采用單花滴注接種法給麥穗接種赤霉菌，每穗接種1朵小花，噴霧保濕并套袋處理，3d后去套袋，生長條件不變。接種赤霉菌15d后，統計平均病小穗率和病穗軸率，對植株赤霉病抗性進行鑒定。

1.7 數據處理

運用Excel 2010軟件進行數據統計、方差分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 TaACS2基因序列特征分析

根據序列信息設計克隆引物，分別在抗赤霉病小麥品種‘望水白’和感病品種‘Alondra’s’中擴增得到TaACS2基因的gDNA，全長2 177bp。序列分析發現，‘望水白’與‘Alondra’s’僅在476bp處有一個SNP位點差異(圖1)。該SNP位點未引起氨基酸變化，是一個同義突變，因此未引起預測的蛋白質三維結構發生變化，蛋白質理化性質也未改變(圖2)。

圖1 TaACS2基因序列分析Fig.1 Sequence analysis of TaACS2 gene

圖2 TaACS2蛋白三維結構Fig.2 Three-dimensional structure of TaACS2 protein

2.2 TaACS2基因受赤霉菌誘導后的表達特征分析

利用設計的目的基因特異引物(表1)對赤霉菌侵染后的‘蘇麥3號’和‘Alondra’s’TaACS2基因表達變化進行實時定量qRT-PCR分析,結果顯示：TaACS2基因在抗病品種‘蘇麥3號’中上調表達，但在感病品種‘Alondra’s’中不受誘導，甚至下調表達(圖3)。

2.3 TaACS2 基因沉默效率分析

在‘蘇麥3號’穗部分別接種BSMV(對照，包含α、β、γ載體)和BSMV：PDS(包含α、β、γ-PDS)病毒，7d后觀察，發現接種BSMV：PDS與對照相比出現明顯退綠癥狀(圖4)，證明PDS基因被成功沉默，本試驗的VIGS系統是可行的。

*表示差異顯著(P<0.05)圖3 小麥TaACS2基因受赤霉菌侵染的表達變化情況Fig.3 Changes of TaACS2 gene expression in wheat infected by Fusarium graminearium

圖4 BSMV(A)和BSMV：PDS(B)侵染‘蘇麥3號’ 穗部7d后的表型Fig.4 The spike symptom of ‘Sumai 3’ at 7 days after inoculation of BSMV(A)and BSMV：PDS(B)

分別對‘蘇麥3號’(圖5A—D)和‘望水白’(圖5E—H)穗部進行TaACS2基因沉默試驗，研究其功能。利用BSMV和BSMV：TaACS2接種植株穗部，7 d后在接種點取樣并提取RNA，利用qRT-PCR分析VIGS對目的基因的沉默效率。結果表明:與對照相比，涂抹BSMV：TaACS2后，‘蘇麥3號’的TaACS2基因表達量下降至原來的5%(圖5D)，‘望水白’的TaACS2基因表達量下降至原來的21%(圖5H)，表明兩個抗病材料中的TaACS2基因均被成功沉默。

A和E：接種BSMV；B和F：接種BSMV：TaACS2；C和G：接種BSMV和BSMV：TaACS2后再接種赤霉菌，15d后統計平均病小穗率和病穗軸率；D和H：接種BSMV和BSMV：TaACS2，7d后檢測TaACS2基因的表達情況圖5 利用VIGS在‘蘇麥3號’(A—D)和‘望水白’(E—H)穗部沉默TaACS2基因Fig.5 Silencing TaACS2 gene in panicles of ‘Sumai 3’(A—D)and ‘Wangshuibai’(E—H)by VIGS

2.4 沉默TaACS2基因后的小麥赤霉病抗性鑒定

為了研究TaACS2基因沉默后小麥的赤霉病抗性是否發生變化，于小麥揚花期分別在BSMV和BSMV：TaACS2侵染后的穗部接種赤霉菌，并于接種后15d調查植株平均病小穗率和平均病穗軸率。結果顯示：與對照(圖5A)相比，TaACS2基因沉默的‘蘇麥3號’(圖5B)平均病小穗率從7.2%上升到13.3%，病穗軸率從4.6%上升到19.0%(圖5C)，感赤霉病性顯著提高。TaACS2基因沉默的‘望水白’(圖5F)平均病小穗率從10.8%上升到28.4%，病穗軸率從0上升到53.6%(圖5G)，感赤霉病性顯著提高。初步證明TaACS2基因正向調控小麥對赤霉病的抗性。

3 討論

目前，小麥抗赤霉病研究工作取得了重大進展，2016年Rawat等[29]克隆了小麥抗赤霉病主效位點Fhb1上的關鍵基因——成孔毒素(PFT)基因。Fhb1位于3BS染色體上，是目前公認的、效應最大的、抗性表現穩定的赤霉病抗性QTL[30]，Fhb1能解釋20%—60%的表型變異[31]，是小麥赤霉病中最佳的抗擴展基因的資源[32]。但前人研究發現，一些具有PFT基因的材料并不抗赤霉病，而沒有PFT基因的材料也能抗赤霉病[33-34]。目前已知的抗赤霉病QTL很多，幾乎遍布小麥全部染色體[5]，所以Fhb1并不能完全解釋小麥赤霉病抗性問題，對小麥赤霉病還需要進行進一步研究。

植物激素在調節植物發育進程和通過信號轉導網絡參與植物對眾多生物和非生物脅迫的響應中起著重要作用，其中水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)在生物脅迫響應中起著重要作用[35]。植物激素乙烯，不僅在調節植株的生長和發育中起作用，而且是環境脅迫和生物脅迫反應的重要調控因子。目前，關于乙烯通路在小麥抗赤霉病反應中所起的作用仍存在分歧，機制并未完全清楚。如Arnaud等[12-15]認為乙烯信號在小麥抗赤霉病中發揮作用，Ding等[36]認為乙烯和茉莉酸兩個信號通路協同參與赤霉病抗性，而Chen等[37]認為乙烯信號通路與感赤霉病性相關。本研究利用大麥條斑花葉病毒誘導基因沉默技術將抗赤霉病材料‘蘇麥3號’和‘望水白’中的TaACS2基因沉默后，抗病材料‘蘇麥3號’和‘望水白’的病小穗率和病穗軸率均上升，抗赤霉病性降低，表明TaACS2基因參與抗赤霉病反應，同時也間接證明乙烯信號通路正向調節小麥對赤霉病的抗性。Gillespie[38]研究發現，利用病毒誘導基因沉默技術沉默乙烯響應元件轉錄因子ERF后，降低了抗病品種‘寧7840’的赤霉病抗性，與本試驗結果一致，表明乙烯合成或信號傳導途徑的破壞或受阻均可影響乙烯通路發揮赤霉病抗性。因此，本試驗鑒定的TaACS2基因為研究乙烯信號通路參與抗赤霉病反應的調控網絡打開了一個突破口，并有助于解析小麥抗赤霉病分子機理。