校園植物凋落葉浸提液對土壤中自身固氮菌生長的影響

馬小明+攔生發+張瑋+李慧+魏學濤

摘 要 采集三種校園植物凋落葉并制備浸提液，按比例配成混合液，處理土壤，然后通過平板涂布法在選擇培養基上培養、篩選并統計自生固氮菌菌落數，從而反映不同植物凋落葉浸提液及不同組合浸提液對自生固氮菌生長的影響。得出不同葉片浸提液組合后促進固氮菌生長的效果好于單一葉片浸提液的作用，且種類越多促進作用越明顯。鑒于此，建議學校在綠化建設不影響美觀情況，選擇多種植物混合搭配種植。

關鍵詞 植物凋落葉 浸提液 自身固氮菌 校園綠化

中圖分類號 Q-33 文獻標志碼 B

1 實驗背景

“綠化”是近些年新校園建設中很重要的一個項目。筆者所任教的學校在新校區的建設中為了秉承校園文化精神，提升校園文化品位，打造甘肅最美校園，建設了多個花壇。但花壇中種植的植物品種單一，主要以紫葉小檗和小葉女貞為主，穿插月季，但長勢不佳。新校區土質不肥，若過一兩年葉落歸根，土質得到改善可以，到時植物長勢會更好。因為葉片中的有機質經微生物分解為無機物，根系可以吸收再利用，同時也滋養了微生物群的發展壯大，使土壤更加肥沃。鑒于此，結合生物選修教材中“驗證細菌分布的廣泛性”“學習微生物培養基本技術”“某種微生物數量的測定”以及“微生物在其他方面的應用”，展開植物葉片浸出液對土壤微生物影響的研究。但土壤中微生物種類繁多、數量龐大，分離鑒定工作難以完成，所以只研究自身固氮菌。

2 實驗目的

初步研究小葉女貞、紫葉小檗、月季三種凋落葉浸提液對自生固氮菌生長的影響；

初步學會微生物培養、分離、鑒定技術；

通過開展此實驗，使所學的書本知識在生物科技活動中得以應用；

通過實驗結果及結論，對校園綠化建設提供可行性建議。

3 實驗原理

不同植物的凋落葉所含成分有所不同，對微生物生長的影響可能不同。自身固氮菌可以從空氣中吸收氮氣，并將其轉化為氨加以利用。固氮原理為：N2+8H++16Mg-ATP+16H2O+8e-→2NH3+H2+16Mg-ADP+16Pi。該反應在固氮酶參與下完成。所以，利用植物自身固氮菌可以固氮的特性，采用無氮源的人工合成培養基（阿須貝培養基）培養和篩選出自生固氮菌，測定菌落數目變化，分析不同植物凋落葉浸提液對自生固氮菌生長、繁殖的影響。

4 實驗材料及用具

材料：三種植物凋落葉（小葉女貞、紫葉小檗、月季）、校園花壇內土壤。

器具：無菌室及超凈工作臺（臨夏州農科院蠶豆中心提供）、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫箱、酒精燈、燒杯、三腳架、石棉網、量筒、天平、電子天平、鐵架臺、玻璃棒、漏斗、放大鏡、培養皿、試管、吸管、錐形瓶、涂布棒、土壤篩、烘干箱等。

耗材：標簽紙、紗布、牛皮紙、記號筆、棉花、報紙等。

固氮菌分離培養基（阿須貝培養基）配方：葡萄糖10 g；NaCl 0.2 g；KH2PO4 0.2 g；CaSO4·2H2O 0.1 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCO3 5 g；瓊脂 20g；水1 000 mL；pH7.0。

5 實驗步驟

5.1 校園小葉女貞、紫葉小檗、月季等植物落葉浸提液制備

（1） 分別收集三種植物落葉，風干，用蒸餾水沖洗去除葉片表面塵土污漬，用酒精進行葉片表面消毒；

（2） 按照表1將不同葉片放入潔凈錐形瓶，用蒸餾水浸泡72 h，得到3種凋落葉浸提液原液。

（3） 用細菌過濾器過濾浸提液原液，既不破壞生長因子、又防止雜菌污染。

（4） 將3種浸提液按表2中比例制備系列浸提液樣液。

以上（1）～（4）步驟均在無菌室中完成。

5.2 土壤獲取及處理

（1） 取土壤，除去表層落葉及其他雜物，采集5～10 cm深處的土樣，裝入塑料袋中，并標注采集的地點、時間等。為了防止土壤中微生物數量和種類發生變化，把土樣暫放在冰箱中保存。

（2） 過1 mm土壤篩，稱取30 g土壤，用烘干法計算土壤濕度。土壤濕度（重量%）=（原土重-烘干土重）/烘干土重×100%=（30.00 g-23.78 g）/23.78 g×100%=26.16%。

（3） 稱取土壤8份，每份20 g，分別置于培養皿（標號依次為A～H）中，分別用A～H浸出液樣液噴灑處理（5 mL/10 g）。在相同條件下，培養已處理土壤2 d。

（4） 分別取已處理的3 g土壤，置于錐形瓶，加蒸餾水200 mL，充分攪拌，得菌懸液8份（標號依次為A～H）。將每份菌懸液均依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，備用（注意做好標記）。

5.3 倒平板

（1） 按照培養基配方配置培養基，用高壓蒸汽滅菌鍋在120℃條件下滅菌20 min。

（2） 倒平板。每個培養皿倒培養基15 mL左右，室溫放置至其凝固。

5.4 平板涂布并培養

（1） 選取細菌懸液10-4、10-5、10-6倍的稀釋液。

（2） 用注射器吸取稀釋液0.2 mL，注入平板上，涂布棒快速涂布均勻。培養皿倒置（注意做好標記）；每種稀釋液做3個重復。

（3） 留下3個培養皿做空白對照（以反映培養基是否被污染）。

（4） 所有培養皿置于35℃恒溫箱保溫培養，48 h后觀察計數。

6 實驗結果

觀察各稀釋度下培養皿中菌落生長狀況，發現在10-5、10-6稀釋度時，培養皿中菌落數太少，甚至沒有菌落形成，故選擇10-4稀釋度下的培養基作為計數樣本，統計數據見表3。

利用表3中平均值計算每毫升菌懸液原液中自身固氮菌數量，并繪制成柱狀圖，結果如圖1所示。

計算公式為：每毫升菌懸液原液中細菌數量=平均值×104×5。

7 實驗結論及建議

由以上結果可以得出：（1） 不同凋落葉浸出液對自身固氮菌生長都具有促進作用，但促進作用不同，C組促進作用最大，B組最小。（2） 不同凋落葉浸出液組合后促進作用較單一落葉浸出液促進作用明顯，且葉片種類越多促進作用越明顯，G組的促進作用>E組/F組/D組。

鑒于以上結論，建議選擇校園綠化植物時，種類不能太單一，在保證美觀基礎上，應盡可能選用多種植物合理混搭種植。這樣有利于一些土壤微生物的生長，而土壤微生物的生長又可改善土質，反過來為植物的生長提供更好的環境，使其進入良性循環。

參考文獻：

[1] 韓斌，孔繼君，鄒曉明，鞏合德.生物固氮研究現狀及展望[J].山西農業科學，2009.（10）：86-89.

[2] 吳翔，甘炳成，賈定洪，蔣元繼，唐杰.一株自生固氮細菌的分離和鑒定[J].西南農業學報，2013，26（1）：255-258.