紫草素對荷肝癌裸小鼠移植瘤生長的抑制作用及機制

武向麗

作者單位：邯鄲市中心醫院藥學部，河北 邯鄲 056001

肝癌是全球及我國發病率和致死率均較高的惡性腫瘤之一，于我國致死率居惡性腫瘤第二位。紫草素是我國傳統中藥品種紫草的活性成分之一，具有增強免疫力、抑制炎癥反應等多方面藥理學作用［1-2］，已見文獻報道紫草素對乳腺癌、子宮內膜癌、白血病、宮頸癌、喉癌等部位腫瘤生長都具有一定的抑制作用［3-7］，但紫草素是否對肝癌生長具有抑制作用的文獻報道尚不多見，本研究將對這一問題進行研究分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和實驗細胞本研究時間為2016年4—8月，選取4～6周齡Balb/C品系裸小鼠，雄性、體質量范圍為18～22 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司［SCXK（滬）2017-0005］提供；所有實驗操作均符合一般動物倫理學要求。人肝癌HepG2細胞株由河北醫科大學細胞生物研究室惠贈。

1.2 藥物與試劑紫草素（中國藥品生物制品檢定所，批號110769-201603，純度≥98%）；注射用順鉑［齊魯制藥（海南）有限公司，10 mg/支，批號1602016］；HE、TUNEL試劑盒購自南京建成生物研究所（批號分別為20141123、20140918）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、bcl-2相關X蛋白質（Bax、bcl-2）抗體（上海碧云天生物技術有限公司，批號201501006、201410013、201405009）。

1.3 荷肝癌裸小鼠模型的制備、分組與給藥參照謝丹等［8］報道的方法制備荷肝癌裸小鼠模型人肝癌HepG2細胞株經解凍復蘇后植入DMEM高糖培養基進行培養，取對數生長期細胞并調整其濃度為2×107個/mL，于右后腿外側皮下注射0.5 mL濃度為2×107個/mL的細胞溶液，以一周后右后腿外側皮下出現＞0.3 cm2移植瘤為模型復制成功。取模型裸小鼠設模型組，紫草素低、中、高劑量組和順鉑組，每組12只，分別隔天一次給予0.9%氯化鈉溶液，紫草素0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg和順鉑2 mg/kg，共給藥6次。

1.4 觀察動物生存狀態和抑制率組織生長狀態觀察各組裸小鼠食欲、精神狀態等；觀察各組裸小鼠抑制率瘤體大小、活動度、硬度等指標。

1.5 瘤量和抑瘤率頸椎脫臼處死動物后剝取腫瘤組織并稱重，抑瘤率（%）＝（模型組瘤重－治療組瘤重）/模型組瘤重×100%。

1.6 腫瘤組織形態檢查和細胞凋亡狀況觀察稱重后瘤體經4%多聚甲醛溶液固定72 h后進行石蠟包埋、切片、展片、水化等處理后，①行HE染色后封片，倒置光學顯微鏡觀察腫瘤組織形態結構；②依照TUNEL試劑盒操作步驟進行處理，倒置光學顯微鏡觀察細胞凋亡狀況（細胞核黃染為細胞凋亡指征），凋亡指數（Apoptosis Index，AI）（%）＝（凋亡細胞數/細胞總數）×100%。

1.7 凋亡相關蛋白表達取1.6步驟水化處理后切片，采用IHC法檢測凋亡相關蛋白［半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、bcl-2相關X蛋白質（Bax、bcl-2）］表達；蛋白表達量通過半定量分析計算：每張切片隨機選取互不重疊的5個視野，通過圖像分析軟件計算每個視野光密度值（OD），以OD值代表蛋白表達密度，并進一步計算Bax/bcl-2表達比值。

1.8 統計學方法運用SPSS 13.0進行數理統計分析，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組裸小鼠生存狀態及腫瘤特征觀察結果模型組裸小鼠精神萎靡、食欲不振，移植瘤呈質硬、活動性強、與胸壁不粘連等特征。紫草素低、中、高劑量組和順鉑組裸小鼠食欲和精神狀態較模型組均明顯改善，瘤體積小、活動度低、硬度低，紫草素干預作用具有一定劑量依賴性。

2.2 各組裸小鼠移植瘤瘤體質量和抑瘤率與模型組比較發現經紫草素中、高劑量組和順鉑治療能夠顯著降低荷肝癌裸小鼠移植瘤質量，差異有統計學意義（P＜0.05），經紫草素低、中、高劑量組或順鉑治療能夠顯著提高抑瘤率，差異有統計學意義（P＜0.01）；紫草素高劑量組和順鉑組比較瘤重、抑瘤率，均差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 紫草素對荷肝癌裸小鼠移植瘤瘤體質量和抑瘤率的影響/±s

表1 紫草素對荷肝癌裸小鼠移植瘤瘤體質量和抑瘤率的影響/±s

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別模型組紫草素低劑量組紫草素中劑量組紫草素高劑量組順鉑組F值P值鼠數12 12 12 12 12瘤體質量/g 1.69±0.14 1.32±0.21 1.18±0.17a 0.83±0.12b 0.76±0.11b 72.509 0.000抑瘤率/%0.00±0.00 21.89±3.75b 30.18±4.92b 50.89±6.43b 55.03±8.17b 194.686 0.000

2.3 各組裸小鼠腫瘤組織形態結構結果如圖1所示：與模型組比較發現，經紫草素低、中、高劑量組或順鉑干預治療后，肝癌移植瘤組織呈現片狀壞死病變，移植瘤組織細胞數量減少、間隙增大，上述作用呈一定劑量依賴性。

2.4 各組裸小鼠腫瘤組織細胞凋亡狀況結果如圖2所示：與模型組比較發現，經紫草素各劑量或順鉑干預治療后荷肝癌裸小鼠移植瘤組織凋亡細胞數量明顯增多，以紫草素高劑量組效果最為顯著。凋亡指數（AI）計算結果：與模型組比較，紫草素低、中、高劑量組和順鉑組AI均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；紫草素高劑量組和順鉑組比較，紫草素高劑量組AI顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 紫草素對荷肝癌裸小鼠腫瘤組織細胞AI的影響

2.5 各組裸小鼠移植瘤caspase-3蛋白表達較模型組，經紫草素低、中、高劑量組或順鉑組治療后荷肝癌裸小鼠移植瘤組織中caspase-3蛋白表達顯著上調，以紫草素2 mg/kg組效果最為顯著；見圖3。半定量分析結果：較模型組，紫草素低、中、高劑量組和順鉑組移植瘤組織caspase-3蛋白表達OD值顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。紫草素高劑量組和順鉑組比較caspase-3蛋白表達OD值，紫草素高劑量組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.6 各組裸小鼠移植瘤組織Bax、bcl-2蛋白表達及Bax/bcl-2表達比值與模型組比較，紫草素低、中、高劑量組和順鉑組移植瘤組織Bax蛋白表達不同程度上調、bcl-2表達不同程度下調，差異有統計學意義（P＜0.05），其中以紫草素高劑量組上述效果最為顯著；見圖4、圖5。半定量分析結果：較模型組，紫草素低、中、高劑量組和順鉑組裸小鼠移植瘤Bax表達OD值明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01），紫草素中、高劑量組和順鉑組bcl-2表達OD值顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），紫草素低、中、高劑量組和順鉑組Bax/bcl-2表達比值顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；紫草素高劑量組和順鉑組比較，紫草素高劑量組Bax/bcl-2表達比值顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），Bax、bcl-2蛋白表達OD值差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組裸小鼠移植瘤組織中caspase-3、Bax、bcl-2表達OD值及Bax/bcl-2表達比值/±s

表3 各組裸小鼠移植瘤組織中caspase-3、Bax、bcl-2表達OD值及Bax/bcl-2表達比值/±s

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與順鉑組比較，cP＜0.05

組別模型組紫草素低劑量組紫草素中劑量組紫草素高劑量組順鉑組F值P值鼠數12 12 12 12 12 caspase-3（OD）0.05±0.02 0.16±0.05a 0.21±0.04b 0.27±0.06bc 0.15±0.04a 37.423 0.000 Bax（OD）0.29±0.05 0.54±0.10b 0.63±0.15b 0.81±0.21b 0.74±0.14b 23.766 0.000 bcl-2（OD）0.50±0.07 0.46±0.11 0.37±0.05a 0.30±0.05b 0.39±0.07a 11.979 0.001 Bax/bcl-2 0.59±0.20 1.17±0.25a 1.70±0.39b 2.71±0.68bc 1.89±0.43b 41.591 0.000

3 討論

肝癌是一種轉移能力和侵襲其它器官組織能力都比較強的癌種之一［9-10］，并且因為肝癌發病較為隱匿，多數病人確診時已錯過手術機會［11］，5年復發率達60%，因此延緩肝癌腫瘤生長、延長病人生存期是臨床上迫切需要解決的醫學難題。

紫草素是一種萘醌類化合物，近年來研究發現紫草素具有抑制多部位腫瘤生長的作用，能夠通過促進內源性活性氧合成而抑制人宮頸癌Hela細胞增殖［5］、通過調節細胞周期時相而抑制喉癌細胞增殖［6］、促進人乳腺癌MCF-7細胞自噬［3］、促進抑制白血病HL-60細胞凋亡并抑制增殖［7］。本實驗結果顯示，紫草素能夠明顯改善荷肝癌裸小鼠食欲和精神狀態、減慢移植瘤生長、降低瘤體硬度、降低瘤體活動度，誘導移植瘤組織片狀壞死、促進腫瘤細胞凋亡，說明紫草素具有抑制荷肝癌裸小鼠移植瘤生長的作用。

細胞凋亡是細胞的一種自助程序性死亡模式，caspase-3、Bax、bcl-2三種蛋白在細胞凋亡過程中發揮著重要調節作用。其中caspase-3蛋白為凋亡刺激因子，為細胞凋亡的“激活器”，Bax能夠改變線粒體膜通透性、促進細胞色素C釋放而誘導細胞凋亡［12］，bcl-2能夠通過抑制caspase-3活性、保護線粒體膜而抑制細胞凋亡［13-15］。此外，Bax蛋白和bcl-2蛋白能夠形成同源二聚體而相互抑制二者活性，因此Bax/bcl-2蛋白表達比值能夠反應二者對細胞凋亡的真實調節作用［16］。本實驗結果顯示，紫草素能夠上調移植瘤組織caspase-3、Bax蛋白表達并下調bcl-2蛋白表達，提高Bax/bcl-2表達比值。

綜上所述，紫草素具有抑制肝癌裸小鼠移植瘤生長的作用，紫草素調節凋亡相關蛋白表達而促進腫瘤細胞凋亡可能是該作用重要的分子機制。

（本文圖1～5見插圖5-1）

圖1 紫草素對荷肝癌裸小鼠腫瘤組織形態結構改變的影響（HE×200倍）：A-模型組；B-紫草素0.5 mg/kg組；C-紫草素1 mg/kg組；D-紫草素2 mg/kg組；E-順鉑2 mg/kg組

圖2 各組裸小鼠腫瘤組織細胞凋亡狀況（TUNEL×200倍）：A-模型組；B-紫草素0.5 mg/kg組；C-紫草素1 mg/kg組；D-紫草素2 mg/kg組；E-順鉑2 mg/kg組

圖3 各組裸小鼠移植瘤組織caspase-3蛋白表達（IHC×200倍）：A-模型組；B-紫草素0.5 mg/kg組；C-紫草素1 mg/kg組；D-紫草素2 mg/kg組；E-順鉑2 mg/kg組

圖4 各組裸小鼠移植瘤組織Bax蛋白表達（IHC×200倍）：A-模型組；B-紫草素0.5 mg/kg組；C-紫草素1 mg/kg組；D-紫草素2 mg/kg組；E-順鉑2 mg/kg組

圖5 各組裸小鼠移植瘤組織bcl-2蛋白表達（IHC×200倍）：A-模型組；B-紫草素0.5 mg/kg組；C-紫草素1 mg/kg組；D-紫草素2 mg/kg組；E-順鉑2 mg/kg組