雜草稻抗白葉枯病基因的篩選與鑒定

伍 豪， 王威豪， 劉百龍， 周 行， 石瑜敏， 韋善富

(1.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530007； 2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家水稻改良中心南寧分中心， 廣西 南寧 530007； 3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,廣西 南寧 530007)

水稻白葉枯病(Bacterial blight,BB)是一種嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量的細(xì)菌性病害，發(fā)掘白葉枯病抗源，培育抗性品種，是防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。近年來，從野生稻中已經(jīng)發(fā)掘出不少新的抗白葉枯病基因，作為同樣具有很強(qiáng)抗逆性和適應(yīng)性的雜草稻卻鮮有抗性基因被發(fā)掘。雜草稻作為稻種資源的一個(gè)特殊類型，具備野生稻和栽培稻的生物學(xué)特性，相對于野生稻，雜草稻的特殊生物學(xué)性狀和抗逆性等優(yōu)良性狀更易于在育種中被直接利用，是水稻品種改良的重要育種資源[1]。WANG等[2]研究表明，雜草稻同栽培稻都是AA基因型，相互之間不存在生殖隔離，兩者能夠自然雜交。郭俊祥等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在雜草稻和普通栽培稻的雜交后代中可篩選出符合育種要求的單株。張忠林等[4]研究表明，雜草稻具有豐富抗源，是抗性基因的供體或載體，可應(yīng)用于水稻品種的選育中。王麗麗等[5]從雜草稻中檢測到了Pita、Pid2、Pid3等抗稻瘟病基因。雖然已有不少學(xué)者開展了對雜草稻的研究，但這些研究大多集中于雜草稻的生物學(xué)特性和危害上，對其有利基因的發(fā)掘利用研究很少。雜草稻在長期的自然選擇中積累了大量的抗病基因，但目前鮮見有對雜草稻抗白葉枯病基因展開鑒定分析的報(bào)道。為進(jìn)一步發(fā)掘雜草稻中的抗白葉枯病基因，筆者等通過人工接種鑒定和分子標(biāo)記檢測相結(jié)合的方法，對148份雜草稻中的抗白葉枯病基因進(jìn)行發(fā)掘和鑒定，旨在為水稻白葉枯病抗性育種提供基礎(chǔ)材料和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試材料為韓國收集于部分亞洲水稻產(chǎn)區(qū)的雜草稻種質(zhì)資源，共148份，感病對照品種為TN1。于2014年春季種植于大田抗病鑒定圃內(nèi)進(jìn)行初次鑒定，并于當(dāng)年晚季進(jìn)行重復(fù)鑒定。參試菌株為華南秈稻區(qū)白葉枯病優(yōu)勢菌株(Ⅳ型)。含抗白葉枯病基因Xa23、Xa21、Xa7的水稻材料IRBB23、IRBB21、IRBB7，作為PCR檢測時(shí)的抗性對照。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種鑒定 取出保存于-80℃冰箱的白葉枯病菌，待其融化后在NA培養(yǎng)基上劃線，然后置于28℃恒溫箱中進(jìn)行活化培養(yǎng)，48 h后將活化好的病原菌取一環(huán)于NB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在28℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，將菌液配制成濃度為 1×10-9cfu/mL的接種菌液。采用剪葉法在分蘗盛期接種，接種20 d左右進(jìn)行病情調(diào)查。病情按病斑占葉片總面積的百分比分級[6]：0～3.0%為高抗(HR)，4%～12.0%為抗(R)，13%～25.0%為中抗(MR)，26%～50.0%為中感(MS)，51%～85.0%為感(S)，86%～100.0%為高感(HS)。

1.2.2 PCR鑒定

采用CTAB法提取雜草稻基因組DNA[7]。Xa21的引物為PTA248[8]，Xa23的引物為M-Xa23[9]，Xa7的引物為RM20582[10]，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為10 μL，5 μL 2×Taq PCR MasterMix(含Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2)，1 μL 模板，1 μL 引物，3 μLdd H2O。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火(溫度隨引物而異)30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，20℃停止、保存。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，再經(jīng)銀染、顯影等程序，得到擴(kuò)增條帶。

表1 PCR鑒定所用引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 雜草稻抗白葉枯病穩(wěn)定材料的篩選

從表2看出，2014年早季，用Ⅳ型菌株接種20 d左右發(fā)現(xiàn)，對照TN1發(fā)病嚴(yán)重，表現(xiàn)高感白葉枯病；148份雜草稻中無高抗和抗水平的材料，中抗水平的有W3、W31、W132等3份材料，占參試材料的2.03%；13份材料為中感，占8.78%；19份材料為感，占12.84%；113份材料為高感，占76.35%。晚季重復(fù)鑒定發(fā)現(xiàn)，對照TN1為高感；仍未有高抗和抗水平的材料，只有1份材料W132為中抗，占參試材料的0.68%；12份材料為中感，占8.11%；17份材料為感，占11.49%；118份材料為高感，占79.43%。統(tǒng)計(jì)2次鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有W132材料在2次鑒定中均表現(xiàn)為中抗水平。表明，148份雜草稻材料中，只有W132對白葉枯病具有穩(wěn)定的抗性，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 雜草稻白葉枯病2014年接種鑒定結(jié)果

2.2 雜草稻抗性基因的鑒定

用Xa23基因的功能標(biāo)記對接種后篩選到的抗病材料W132進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，在IRBB23中擴(kuò)增出200 bp左右的抗病條帶，在W132和感病對照材料TN1中擴(kuò)增出大約350 bp的感病條帶(圖1)，說明在W132中不含抗性基因Xa23。Xa21基因的功能標(biāo)記檢測表明，在IRBB21中擴(kuò)增出1 000 bp左右的抗病條帶，在W132和TN1中擴(kuò)增出700 bp左右的感病條帶，說明在W132中不含抗性基因Xa21。利用與Xa7基因緊密連鎖的標(biāo)記RM20582對IRBB7、W132、TN1檢測表明，在IRBB7和W132中擴(kuò)增出大約83 bp的抗病條帶，在TN1中為感病條帶，說明在W132中含有抗白葉枯病基因Xa7。

3 結(jié)論與討論

雜草稻作為一種特殊的稻種資源，國內(nèi)外對其研究由來己久，但多集中在起源、生物學(xué)特性以及生態(tài)控制等方面。近年來部分學(xué)者開展了雜草稻種質(zhì)資源利用方面的研究，袁曉丹等[11]認(rèn)為，雜草稻對環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，積累了大量的抗逆遺傳因子，在水稻改良特別是在抗性育種上是優(yōu)良的稻種資源庫；SUH等[12]從米質(zhì)、雜種親合性、發(fā)芽特性、開花特性及抗性等方面對雜草稻開展了大量的研究，還嘗試?yán)每沟疚敛‰s草稻進(jìn)行水稻育種研究，同時(shí)分析了與韓國雜草稻低溫發(fā)芽特性相關(guān)的QTL位點(diǎn)；曹卿等[13]利用標(biāo)記ST10對江蘇省部分地區(qū)雜草稻抗條紋葉枯病基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有5份材料可能攜帶抗條紋葉枯病基因Stv-bi，可進(jìn)一步在育種中利用。因此，開展雜草稻抗白葉枯病基因的發(fā)掘鑒定研究，可進(jìn)一步提升雜草稻作為特殊稻種資源的利用價(jià)值。

前人對雜草稻中的抗稻瘟病基因和抗條紋葉枯病基因等抗病基因開展了鑒定，但鮮見有對雜草稻中的抗白葉枯病基因開展鑒定的報(bào)道。本研究利用華南秈稻區(qū)白葉枯病優(yōu)勢菌株Ⅳ型菌對148份雜草稻種質(zhì)在早季和晚季進(jìn)行重復(fù)接種鑒定，獲得1份穩(wěn)定的中抗白葉枯病的材料W132，在利用分子標(biāo)記對具有廣譜抗性的抗白葉枯病基因Xa23、Xa21及Xa7進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，W132中擴(kuò)增出Xa23和Xa21基因的感病條帶以及Xa7基因的抗性條帶，表明W132中不含抗白葉枯基因Xa23和Xa21，含有抗白葉枯基因Xa7。本研究進(jìn)一步印證張忠林等[4]的研究結(jié)果，雜草稻具有較多的抗逆性狀，是一種改良栽培稻抗逆性的天然基因庫，可直接用作保持系的選育，也可作中間材料用于恢復(fù)系的改良。因此，研究所獲得的含有Xa7基因的雜草稻W(wǎng)132，可進(jìn)一步運(yùn)用到白葉枯抗病育種中，以拓寬水稻抗白葉枯病育種的材料基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步發(fā)掘雜草稻中的抗白葉枯病基因提供理論參考。