芽孢桿菌的生防活性及其發(fā)酵條件優(yōu)化

劉瑩瑩， 曲甜甜， 張丹雨， 卜 寧

(沈陽(yáng)師范大學(xué)， 遼寧 沈陽(yáng) 110034)

土地荒漠化是我國(guó)乃至世界上最嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境災(zāi)難。遏制和治理土地沙化，改善生態(tài)條件，維持并擴(kuò)大人類(lèi)的生存空間，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展已成為亟需解決的重要問(wèn)題。目前，土壤荒漠化治理的方法中，微生物菌肥因具有諸多優(yōu)勢(shì)而成為重要研究方向[1]。微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的重要組成成分，而土壤中的芽孢桿菌(Bacillus)是一類(lèi)重要的植物根際促生菌(plant growth Promoting rhizobacteria，PGPR)，因其具有較強(qiáng)抗逆性等生物學(xué)功能而成為生物菌肥研制和生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的潛質(zhì)菌源。筆者以從蒙遼交界沙化土壤中分離出2株芽孢桿菌STW-2和STW-64為菌源，前期研究鑒定STW-2為阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)；STW-64為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，測(cè)定菌株對(duì)植物病原菌的拮抗活性，并對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為蒙遼交錯(cuò)帶破碎化草地的植被恢復(fù)提供生物菌肥和生物農(nóng)藥的研發(fā)菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試供菌株 試供芽孢桿菌：菌株SWT-2(阿氏芽孢桿菌Bacillusaryabhattai)和SWT-64(巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium)，均分離自蒙遼交界阜新彰武縣章古臺(tái)鎮(zhèn)的沙化土壤，由沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

植物病原真菌：玉米大斑病菌(Cornnorthernleafblight)、玉米彎孢葉斑病菌(CurvularialunataBoed)、玉米頂腐病菌(Pythiumspp)、玉米圓斑病菌(Drechsleracarbonum)、玉米穗腐菌(Maizeearrot)、玉米黑束菌〔Ustilagomaydis(DC)Corola〕、番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)、蘋(píng)果霉心病-粉紅聚端孢菌(Applemoldycore)、辣椒疫霉病菌(phytophthoracapsici)、黃瓜花腐病菌(Stemrotofcucumber)、黃色鏈孢菌(HuangSelianPestalotiopsis)、甜瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、高粱靶斑病菌(LeafSpotinSorghum)、向日葵核盤(pán)菌(SunflowerSclerotiniasclerotiorum)，均由沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL、pH 7.0～7.2；PDA培養(yǎng)基(培養(yǎng)指示真菌)：土豆200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL、自然pH。

1.2 對(duì)植物病原菌的拮抗活性測(cè)定

分別將已活化的2株試供芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，26℃、120 r/min發(fā)酵24 h，備用。用直徑為5 mm的濾紙片蘸取供試芽孢桿菌發(fā)酵液放置于新PDA平板中央。將已活化的植物病原指示菌分別接種于PDA平板培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)7 d，在菌落邊緣選取直徑5 mm的菌餅，在距離濾紙片2 cm處等距離處放置3個(gè)植物病原菌菌餅，每個(gè)處理3次重復(fù)，以未接供試芽孢桿菌(無(wú)菌水)的處理為對(duì)照。接菌后26℃培養(yǎng)5 d，測(cè)量抑菌圈大小，計(jì)算抑菌率。抑菌率(%)=[r1-(d-r2)]/r1×100，其中，r1為兩病原菌心間距離，r2為菌心到病原菌垂直距離，d為菌心到病原菌心間距離。

1.3 菌株不同發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.1 培養(yǎng)時(shí)間 將2 株供試芽孢桿菌分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，26℃、120 r/min培養(yǎng)18 h制備種子培養(yǎng)液，備用。以5%接種量將2供試芽孢桿菌種子培養(yǎng)液分別接種于含有50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的150 mL三角瓶中，26℃、120 r/min培養(yǎng)，分別在0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、90 h、102 h測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值，以未接菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液為空白對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600為縱坐標(biāo)繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 碳、氮源 最佳碳源：以不含碳源的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，分別加入葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖，以不加碳源的培養(yǎng)基為對(duì)照，分別接種1%的供試芽孢桿菌種子培養(yǎng)液，26℃、120 r/min培養(yǎng)16 h，測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值，每個(gè)處理3次重復(fù)。最佳氮源：以不含氮源的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，分別加入蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨，以不加氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照，分別接種1%的供試芽孢桿菌種子培養(yǎng)液，26℃、120 r/min培養(yǎng)16 h，測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.3 無(wú)機(jī)鹽 以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，分別加入CaCO3、KH2PO4、NaCl、MgSO4，以不加無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基為對(duì)照，分別接種1%的供試芽孢桿菌種子培養(yǎng)液，26℃、120 r/min培養(yǎng)16 h，測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.4 初始NaCl濃度 以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，在含有0、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、5%NaCl的培養(yǎng)液中分別接種1%的供試芽孢桿菌種子培養(yǎng)液，26℃、120 r/min培養(yǎng)16 h，測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.5 初始pH 以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，在初始pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12培養(yǎng)液中分別接種1%的供試芽孢桿菌種子培養(yǎng)液，26℃、120 r/min培養(yǎng)16 h，測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.6 正交試驗(yàn) 以蔗糖為碳源、蛋白胨和酵母浸粉2個(gè)相近氮源、KH2PO4、pH作STW-2菌株的5因素4水平正交試驗(yàn)；以葡萄糖為碳源、蛋白胨和酵母浸粉2個(gè)相近氮源、KH2PO4、pH作STW-64菌株的5因素4水平正交試驗(yàn)，以確定2個(gè)菌株最優(yōu)發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株對(duì)植物病原菌抑菌活性

由表1可知，SWT-2菌株對(duì)蘋(píng)果霉心病菌、辣椒疫霉菌、黃色鏈孢菌、玉米穗腐菌、玉米圓斑菌5種植物病原菌具有抑菌活性；STW-64菌株對(duì)甜瓜枯萎病菌、蘋(píng)果霉心病菌、辣椒疫霉菌、黃色鏈孢菌、玉米穗腐菌、玉米圓斑菌6種植物病原菌有抑菌活性。STW-2、STW-64菌株的抑菌率均在35%以上，其中兩者對(duì)蘋(píng)果霉心病-粉心聚端孢(Applemoldycore)的拮抗活性最高，抑菌率分別為63.2%和64.2%。

表1 2株芽孢桿菌對(duì)植物病原菌的抑菌活性

注：表中數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)的平均值。

Note: The data in the table were the average values of 3 replicates.

2.2 菌株的優(yōu)化發(fā)酵條件

2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間 由圖1可見(jiàn)，隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)液的OD600值呈先升高后降低趨勢(shì)，菌株STW-2的OD600值在0～24 h內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而加大，菌數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)，在24 h時(shí)達(dá)到最大；24 h以后，OD600值隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而減少，直至菌數(shù)不再增加，整個(gè)群體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期、衰亡期。菌株STW-64的OD600值在0～48 h內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而加大，菌數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)，在48 h時(shí)達(dá)到最大；48 h以后，OD600值隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而減少，直至菌數(shù)不再增加，整個(gè)群體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期、衰亡期。

2.2.2 碳、氮源 從圖2可看出，STW-2菌株在以蔗糖為碳源時(shí)，菌株生長(zhǎng)最好，且顯著高于其他碳源；以酵母浸粉為氮源時(shí)，生長(zhǎng)最好，且顯著高于其他氮源。STW-64菌株在以葡萄糖為碳源時(shí)，菌株生長(zhǎng)最好，以蛋白胨為氮源時(shí)，菌株生長(zhǎng)最好。

圖2不同碳、氮源處理菌株的OD值

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽 由圖3可見(jiàn)，氯化鈉對(duì)STW-2菌株的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，而另外3種因素可顯著抑制其生長(zhǎng)；對(duì)于菌株STW-64來(lái)說(shuō)，氯化鈉和硫酸鎂能夠顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)，碳酸鈣則顯著抑制其生長(zhǎng)，磷酸氫二鉀對(duì)其無(wú)顯著影響。2株菌株均在NaCl為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好。

圖3不同無(wú)機(jī)鹽處理菌株的OD值

Fig.3 OD values of strains treated with different inorganic salts

2.2.4 初始NaCl濃度 由圖4所示，培養(yǎng)基中NaCl濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)有顯著影響。在鹽濃度小于3%時(shí)，STW-2和STW-64菌株的生長(zhǎng)量隨著鹽濃度的變化而保持穩(wěn)定，鹽濃度增加到5%時(shí)，生長(zhǎng)量顯著下降，說(shuō)明2種菌株生長(zhǎng)受到影響，耐鹽的最大值為3%左右。

2.2.5 初始pH 由圖5可知，pH為4～5時(shí)，2株菌的菌體數(shù)量隨著初始pH的增大而加大，菌數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)，pH為6時(shí)達(dá)到最大；pH 為9～12時(shí)，2株菌的菌體數(shù)量隨著初始pH的增大而減少。

2.2.6 正交試驗(yàn) 由表2可見(jiàn)，STW-2菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的影響因素，由R值得出碳源(葡萄糖)>pH>緩沖物質(zhì)(磷酸二氫鉀)>氮源(蛋白胨)>氮源(酵母浸粉)；由K值可知：碳源的最適濃度為A3，最適pH為F3即為7，磷酸二氫鉀的最適濃度為D2，蛋白胨的最佳濃度為B2，酵母浸粉的最適濃度為C4。則STW-2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基最好水平組合為A3B2C4D2E3，即：蔗糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.5%，磷酸二氫鉀0.5%，pH為7。STW-64菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的影響因素，由R值得出pH>緩沖物質(zhì)(磷酸二氫鉀)>碳源(葡萄糖)>氮源(酵母浸粉)>氮源(蛋白胨)；由K值可知：碳源的最適濃度為A3，最適pH為F3即為7，磷酸二氫鉀的最適濃度為D2，蛋白胨的最佳濃度為B2，酵母浸粉的最適濃度為C3。則STW-64菌株發(fā)酵培養(yǎng)基最好水平組合為A3B2C4D2E3，即：葡萄糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.0%，磷酸二氫鉀0.5%，pH為7。

表2 STW-2與STW-64菌株菌株的正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

以菌抑菌的生物防治方法不污染環(huán)境具有廣闊前景。芽孢桿菌是植物病害生防微生物的重要組成部分，具有顯著的生防潛力，能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖[2]。目前用于生物防治的高效拮抗菌主要有芽孢桿菌類(lèi)的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、多 粘 芽 孢 桿 菌(Paenibacilluspolymyxa)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)[3]。巨大芽孢桿菌是一種常見(jiàn)的多功能微生物，在土壤解磷、農(nóng)藥降解、污水處理及生物堆肥等領(lǐng)域均有應(yīng)用[4-5]。許愛(ài)玲等[6]采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定了地衣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌對(duì)棉花枯萎病菌和黃萎病菌均有明顯抑制作用；孫龍生等[7]對(duì)巨大芽孢桿菌BM1259的抑菌活性測(cè)定及體內(nèi)拮抗試驗(yàn)表明，巨大芽孢桿菌能顯著降低異育銀鯽腸道氣單胞菌的數(shù)量，提示巨大芽孢桿菌可作為潛在的水產(chǎn)專(zhuān)用微生態(tài)制劑。2009年，印度海德拉巴國(guó)家研究所發(fā)射帶低溫采樣器的熱氣球，分離出20～41 km平流層中芽孢桿菌新種，將其以印度天文學(xué)家阿耶波多的名字命名為阿耶波多氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)，簡(jiǎn)稱(chēng)阿氏芽孢桿菌[8]。阿氏芽孢桿菌J-6具有對(duì)人、畜、農(nóng)作物安全和環(huán)境友好的特點(diǎn)，對(duì)煙草黑脛病防治有顯著效果[9]。從苜蓿根際分離出主要的株芽孢桿菌均能拮抗2種及以上供試植物病原真菌，同時(shí)具有不同程度的促生作用[10]。

研究的2株菌株通過(guò)平板對(duì)峙法檢測(cè)菌株對(duì)植物病原菌的抑菌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STW-2、STW-64菌株分別對(duì)5種和6種植物病原真菌具有明顯的拮抗活性，抑菌率均在49%以上，其中對(duì)蘋(píng)果霉心病-粉心聚端孢(Applemoldycore)的拮抗活性最高，抑菌率分別為63.2%和64.2%；這與許愛(ài)玲等[6]的研究結(jié)果相似，表明巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌均有抑制植物病原菌生長(zhǎng)的能力，均有生物防治有益菌的潛力，但未進(jìn)行菌株提高抑菌能力的培養(yǎng)條件優(yōu)化，此方面還有待后續(xù)深入研究，提高這2株芽孢桿菌的生物防治能力是關(guān)鍵。

發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化在微生物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中舉足輕重，是從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)生產(chǎn)的必要環(huán)節(jié)。單因素試驗(yàn)搭配正交試驗(yàn)是培養(yǎng)基優(yōu)化的一般方法。劉露等[11]通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化巨大芽孢桿菌BM05的發(fā)酵條件，提高其發(fā)酵活菌數(shù)。王繼雯等[12]為了提高巨大芽孢桿菌C2產(chǎn)芽孢的形成率，采用單因素和正交試驗(yàn)，通過(guò)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)影響巨大芽孢桿菌C2芽孢形成的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。該研究同樣采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)合的方法，優(yōu)化2株芽孢桿菌的培養(yǎng)基，結(jié)果表明STW-2的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為蔗糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.5%，磷酸二氫鉀0.5%，pH為7，26℃，120 r/min；STW-64的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.3%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉1.0%，磷酸二氫鉀0.5%，pH為7，26℃，120 r/min。為以后菌株投入工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。2株菌具有巨大的生物肥料、生物防治潛質(zhì)并且有望在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用，并對(duì)改善當(dāng)?shù)厣惩恋丨h(huán)境的有積極意義。