大鼠腦缺血再灌注時右美托咪定對JAK1/STAT1信號通路的影響

謝桂玲 王東偉 張麗麗 魏嘉楠 王俞婷

佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江省佳木斯市 154007

JAK/STAT途徑廣泛參與神經元生長、分化、凋亡等過程，并且脊髓損傷時，JAK1/STATl信號通路的激活能夠誘發促炎因子釋放、神經元細胞凋亡及髓鞘脫失，從而加重脊髓損傷,諸多研究已證明，JAK/STAT信號通路與脊髓損傷的神經生長和膠質瘢痕形成具有直接關系。而且在大腦缺血后STAT1被激活，引起大腦缺血性損傷，并且在心肌缺血再灌注損傷中[1]也發現STAT1激活引起細胞凋亡。右美托咪定為α2-腎上腺素受體激動劑美托咪定的右旋異構體，本品對中樞α2-腎上腺素受體激動的選擇性更強，從而發揮鎮靜、鎮痛的作用，研究表明，右美托咪定廣泛應用于神經保護麻醉,對腦組織的缺血缺氧性損傷也具有明顯的保護效應[2-3]，因此本文將探討大鼠腦缺血時右美托咪定對JAK1/STAT1信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 選取體重220～260g，SD大鼠40只，由佳木斯大學動物實驗中心提供，隨機分為5組，每組8只，術前12h禁食，不禁水：假手術組(C組)、缺血再灌注組(I/R組)、右美托咪定25μg/kg組(D1組)、右美托咪定50μg/kg組(D2組)、右美托咪定75μg/kg組(D3組),實驗開始時，C組僅進行外科操作暴露頸外動脈而不造成腦缺血，I/R組進行腦缺血操作30min前腹腔內注射無菌生理鹽水1ml，D1組、D2組、D3組分別腦缺血操作30min前腹腔內注射右美托咪定25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg。缺血120min后，實現缺血再灌注處理。

1.2 大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型制備 采用改良線栓法制備大鼠左側大腦中動脈缺血再灌注模型(Middle cerebral artery obstruction,MCA)[4]誘發大腦中動脈(MCA)供血區域的局灶。腹腔麻醉大鼠，剪去大鼠頸部絨毛備皮，旁正中切口3～4cm，暴露胸鎖乳突肌，分離左側頸總動脈，向上分離至左頸外動脈(External carotid artery,ECA)遠端1cm，結扎頸外動脈及其分支，用蛙心夾夾閉頸內動脈(Internal carotid artery , ICA)近心端及頸總動脈(Common carotid artery,CCA)近心端，在ECA結扎處近端與CCA分叉處之間做一小切口，將選取好的栓線自左ECA插入CCA分叉處，從切口處將線栓插入左ICA，松開蛙心夾，輕柔推進，稍感阻力即止，此時插入深度為16～20mm，阻斷2h后，拔出栓線，行CCA,ICA再灌注。觀察大鼠眼虹膜，當顏色變淺時出現神經缺損癥狀認為模型制備成功。

1.3 大鼠學習記憶功能測評評分標準(Neurological deficit scores) 動物模型建立待大鼠蘇醒后，于相應時段由一位不了解分組情況的觀察者參照Zea-Longa[4]的5分制評分標準，進行評估并記錄神經功能缺損評分，具體評分標準如下:0分:無任何神經功能缺損癥狀；1分:輕微神經功能缺損，不能完全伸展缺血灶對側(左側)前爪;2分:中度局灶性神經功能缺損，行走時向缺血灶對側(左側)轉圈；3分:重度局灶性神經功能缺損，站立時向缺血灶對側(左側)傾倒；4分:不能自發行走，甚至意識喪失。神經功能缺損達1～3分者納入實驗。

1.4 Western blotting法檢測蛋白表達水平 大鼠于再灌注24h時斷頭取腦，在冰上分離缺血側頂葉皮層大腦組織，勻漿，提取蛋白。蛋白定量后，每孔加樣量為50μg蛋白。上樣于8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，加入p-JAK1兔多克隆抗體(1∶100，由SANTACRUZ公司提供)、p-STAT1鼠單克隆抗體(1∶1 000，由EPITOMICS公司提供)及抗β-cation(1∶500，由碧云天公司提供)抗體，4℃過夜。洗膜，加入二抗(山羊抗兔/兔抗小鼠IgG 1∶5 000，由碧云天公司提供)孵育，發光，記錄結果。蛋白條帶進行相對密度掃描并分析。

2 結果

2.1 右美托咪定對缺血再灌注損傷大鼠神經功能的影響 假手術組大鼠神經功能正常，腦缺血再灌注組大鼠表現出明顯神經功能缺損癥狀，而右美托咪定組大鼠神經功能缺損癥狀均獲不同程度的改善，I/R組與C組比較差異具有統計學意義(P=0.007)，D1組、D2組、D3組與I/R組比較差異具有統計學意義(P=0.001、0.00、0.00)。見表1。

表1大鼠的神經功能評分

注：與C組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05。

2.2 不同組別大鼠腦組織中p-JAK1、p-STAT1的表達 Western-blotting法檢測C組未見明顯p-JAK1、p-STAT1蛋白的表達，I/R組腦缺血再灌注區腦組織p-JAK1、p-STAT1蛋白表達明顯增多，D1組、D2組、D3組p-JAK1、p-STAT1蛋白的表達均有所減少。I/R組與C組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，D1組、D2組、D3組與I/R組相比差異具有統計學意義(P<0.05),D1組、D2組、D3組，兩兩組間相比差異具有統計學意義。見表2及圖1、2。

表2大鼠腦組織p-JAK1,p-STAT1蛋白的表達

注：與C組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05；與D1組比較，d、eP<0.05；與D2組比較，eP<0.05。

圖1大鼠腦組織p-JAK1蛋白表達

圖2大鼠腦組織p-STAT1蛋白表達

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一個極為復雜的病理生理過程，如何抑制腦缺血再灌注損傷己成為研究的熱點。這個過程目前認為涉及到ATP的生成障礙、興奮性氨基酸毒性作用、細胞內酸中毒、鈣離子超載、炎性因子的釋放及凋亡調控基因激活等諸多機制。

Mascareno等[5]曾報道過JAK/STAT3通路參與了心肌缺血再灌注損傷的病理過程，近年來JAK2/STAT3通路也被證實參與神經元損傷的病理過程，這一觀點現已被很多研究證實，Oshima等[6]也曾研究證實STAT3在心肌缺血再灌注損傷誘導的腦損傷這一病理過程起著重要調節作用。JAK1幾乎在所有細胞中表達，是一種重要的酪氨酸蛋白激酶，其與γ鏈亞單位受體家族(IL-2、IL-4、IL-7、IL-21)及gp130亞單位受體家族(IL-6、IL-11、CNF、G-CSF)均可發生偶聯反應。研究表明大量細胞因子如IL-6-JAK1-STAT3、GM-CSF-JAK1-STAT5信號的轉導途徑過程中均可促使JAK1介導不同下游因子STATs，從而激活不同信號轉導通路[7]。腦組織局部創傷主要原因之一是發生腦功能障礙時引起相關炎癥因子(TNF-α、 IL-6、IL-1等)釋放增多進而導致炎癥性損傷。研究發現[8],右美托咪定能顯著改善大鼠神經功能缺失評分，通過降低缺血性腦損傷模型的血清炎癥因子濃度水平，減小大鼠腦梗死面積，起到神經保護的效應。根據本文結果顯示，右美托咪定50μg/kg時，腦皮質JAK1/STAT1信號通路表達顯著減少，由于試驗數量限制，右美托咪定對腦缺血損傷保護的最有利劑量仍有待研究，同時，右美托咪定劑量對腦缺血損傷的保護是否呈相關性還有待研究，由于右美托咪定對腦缺血再灌注的保護機制研究眾多，本研究只是其中之一，其他機制還有待進一步研究。