鹵料提取物對氧化誘導鴨肉肌原纖維蛋白功能特性和結構的影響

梅甜恬，唐潔，夏楊毅,2*，唐棋，張建華，張國星

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

蛋白氧化包括直接被活性物質誘導和間接與氧化應激副產物反應引起共價修飾[1]，是一個自由基鏈式反應過程，主要由羥自由基(·OH)、肌紅蛋白自由基和脂類次級氧化產物誘導引發，其中·OH被認為是活性氧自由基中氧化能力最強的自由基[2]。在肉制品加工貯藏過程中，肌原纖維蛋白(myofibrillar protein, MP)容易受到自由基攻擊發生氧化，致使結構和功能特性發生變化，從而降低肉類品質和營養價值，如嫩度和持水性下降[3]，影響蛋白質消化吸收[4]等。

二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、丁基羥基茴香醚(butyl hydroxyanisole,BHA)等[5]是常用的合成抗氧化劑，具有較好的抗氧化效果，但對人體有潛在危害，如誘發畸形和癌癥[6-7]。香辛料是一類具有芳香和辛香等風味的天然植物，主要用于改善食品風味，包括增加香氣、著色及消除異味等。同時，還具有抗氧化[8]的生理功能，可以作為天然抗氧化劑，如桂皮[9]、八角[10]、迷迭香[11]、丁香[12]等。復配香辛料在食品加工、餐飲等行業應用眾多，其中復合香辛料鹵制是醬鹵肉制品重要的加工環節之一，賦予了鹵肉制品獨特的風味，但對鹵料的抗氧化特性研究較少。實驗以醬鹵肉制品鹵料配方為參照，分析鹵料對肌原纖維蛋白結構和功能特性的影響，探討鹵制過程中鹵料抗氧化作用，也為鹵料作為抗氧化劑應用于醬鹵肉制品保藏提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨腿肉，重慶北碚永輝超市，放入-18 ℃低溫冰箱凍藏；肉桂、良姜、八角等香辛料，重慶市天生農貿市場。

K2HPO4、疊氮鈉、二硝基苯肼、三氯乙酸:分析純，成都市科隆化工試劑廠；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、鹽酸胍、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基磺酸鈉(SDS)：分析純，Biosharp公司；牛血清蛋白：分析純，上海伯奧生物科技有限公司； SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京索來寶科技有限公司。

1.2 儀器設備

水浴恒溫振蕩器(SHZ-B)，上海龍躍儀器設備有限公司；超低溫冰箱(DW-25W518)，青島海爾電器有限公司；可見分光光度計(722-P)，上海現科儀器有限公司；冷凍離心機(Avanti J-30I)，美國貝克曼庫爾特公司；內切式勻漿機(XHF-D)，寧波新芝生物科技有限公司；漩渦混勻器(XW-80A)，上海青浦滬西儀器廠；拉曼光譜儀(DXR2)，美國Thermo Fisher Scientific公司；醫用冷凍離心機(TGL-16)，四川蜀科儀器有限公司；小型垂直電泳槽(Power Pac Basic)，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(G:BOX)，美國基因公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 鹵料提取物制備

鹵料配方F參考武蘇蘇等[13]方法略作修改。肉桂、良姜12%；八角、香葉、山奈、白芷、小茴香、甘草、陳皮、草果8%；砂仁、豆蔻4%；辣椒3%；丁香1%。

提取方法參考賈娜等[14]方法略作修改。鹵料洗凈后烘干，搗碎，過60目篩，分別取50 g到三角瓶中，按料液比1∶8添加蒸餾水/體積分數為95%的乙醇，在55 ℃水浴搖床中搖勻12 h，用0.45 μm濾膜真空抽濾，按料液比1∶7向殘渣中加入蒸餾水/體積分數為95%的乙醇，重提12 h后過濾。合并濾液并在旋轉蒸發儀中濃縮，最后分別用蒸餾水/體積分數為95%的乙醇定容至100 mL，得到鹵料提取物(質量濃度相當于500 g/L)，將醇提物和水提物分別標記為FC、FS，保存于4 ℃冰箱中待用。

1.3.1.2 肌原纖維蛋白提取

參考CAO等[15]的方法略有修改。稱取 10 g鴨肉絞碎，加入4倍體積冰浴緩沖液 A(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L EGTA，10 mmol/L K2HPO4，pH 6.25)混合均勻。紗布過濾除去筋腱結締組織，10 000 r/min勻漿 60 s，5 500 r/min，4 ℃，離心10 min取沉淀，重復以上操作2次。離心后向沉淀中加入 4倍體積冰浴緩沖液 B(100 mmol/L NaCl，1 mmol/L NaN3，pH 6.25)，2 000 r/min勻漿 60 s。5 500 r/min，4 ℃，離心10 min，棄上清液取沉淀，重復上述操作，最后所得沉淀即為MP膏體。

1.3.1.3 肌原纖維蛋白氧化誘導

用pH值6.25的磷酸鹽緩沖溶液稀釋MP膏體，雙縮脲法測定蛋白質質量濃度并調節至40 mg/mL。將其分為5組，第1組不添加抗氧化劑也不進行氧化處理(記為NonOx組)，其余4組進行氧化處理，其中第2組不添加抗氧化劑(記為Ox組)，第3～5組分別添加體積分數0.05%(以蛋白終濃度計)的FC、FS和0.01%BHT(分別記為Ox+FC組、Ox+FS組和Ox+0.01%BHT組)，攪拌均勻后加入Feton氧化體系(10 μmol/L FeCl3，100 μmol/L抗壞血酸，1 mmol/L H2O2)于4 ℃氧化12 h，用冷凍離心機8 000 r/min離心10 min，取沉淀。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 多酚含量測定

采用Folin-酚法[16]測定多酚含量。以沒食子酸為標準品，將其配制質量濃度為100 μg/mL沒食子酸標準儲備液。分別吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL標準儲備液于10 mL比色管中，加入0.2 mL Folin-酚試劑，混勻，再加入0.5 mL飽和Na2CO3溶液，用蒸餾水稀釋至10 mL，27 ℃水浴1 h后，在波長765 nm處測量吸光度值，繪制標準曲線，得到回歸方程Y=0.009 7x+0.062 5，R2=0.998 3。

準確吸取0.5 mL鹵料提取物于10 mL比色管中，根據上述方法測定吸光度值。通過回歸方程計算多酚含量，以每克復合香辛料計，單位為mg/g。

1.3.2.2 還原力測定

參考袁婭等[17]的測定方法略有改動。分別吸取0.4 mL 5 mg/mL的FC、FS和BHT溶液(由體積分數為95%乙醇配制，且體積分數為0.01%、0.02%)于試管中。依次加入1.8 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.6)和1 mL 10%鐵氰化鉀溶液。混合均勻后于50 ℃水浴30 min，急速冷卻。加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，4 000 r/min離心15 min。取1 mL上清液，依次加入2 mL蒸餾水和0.2 mL質量濃度為1 mg/mL的三氯化鐵溶液，混合均勻。放置10 min后，在波長700 nm處測吸光度，以吸光度值(A700nm)表示還原能力大小。

1.3.2.3 羰基含量測定

參考OLIVE[18]等的方法略作改動。用雙縮脲法測定蛋白質量濃度并調節至5.0 mg/mL。取2 mL樣品溶液于離心管中，加入2 mL 10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼(對照組加入 2 mol/L HCl，其余操作相同)，室溫暗處靜置1 h(每隔10 min漩渦1次)。隨后加入2 mL 20%三氯乙酸，10 000 r/min離心15 min，取沉淀。用2 mLV(乙醇乙酯)∶V(乙醇)=1∶1混合液洗滌沉淀3次，加入5 mL pH 6.5鹽酸胍溶液，37℃下溶解沉淀20 min，于10 000 r/min離心5 min，去除不溶性部分。樣品在370 nm處測定吸光值，羰基濃度用摩爾消光系數22.0 mo1/(L·cm)來計算，羰基含量表示為nmol/mg。

1.3.2.4 總巰基含量測定

參考SIMPLICIO[19]等的方法。取1 mL質量濃度4 mg/mL的樣品溶液，加入8 mL Tris-甘氨酸溶液，然后經均質和10 000 r/min離心15 min，除去不溶性蛋白。取4.5 mL上清液加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑，30 min后在412 nm處測定吸光值。空白不加蛋白溶液，其他方法相同。巰基濃度計算使用摩爾消光系數13 600 M-1·cm-1，計算如公式(1)所示：

(1)

其中A，樣品在412 nm處的吸光度；C，樣品的蛋白的濃度，mg/mL。

1.3.2.5 濁度測定

參考韓敏義等[20]的方法測定，用冰浴磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，50 mmol/L Na2HPO4，pH 6.25)溶解肌原纖維蛋白，2 800 r/min混合勻漿36 s，最終稀釋為質量濃度2.5 g/L的溶液。在室溫下放置20 min后，以磷酸鹽緩沖液為空白，在波長340 nm處測定吸光值，以該吸光值為肌原纖維蛋白的濁度。

1.3.2.6 溶解度測定

參考AGYARE等[21]的方法測定，將1.3.2.5中得到的2.5 mg/mL的蛋白質溶液在4 ℃下靜置1 h，5 500 r/min 4 ℃離心15 min，取上清液，用雙縮脲法測定肌原纖維蛋白溶液的濃度，空白用未添加肌原纖維蛋白的磷酸鹽緩沖液替代。肌原纖維蛋白溶解度的計算公式為：

(2)

1.3.2.7 疏水性測定

參考CHIN等[22]的方法測定，用冰浴20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.25)溶解肌原纖維蛋白，2 800 r/min混合勻漿36 s，最終稀釋為質量濃度5 g/L的蛋白溶液。取1 mL樣液于離心管中并加入200 μL 1mg/mL溴酚藍，室溫漩渦10 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋10倍后在波長595 nm處測定吸光值，空白用未添加肌原纖維蛋白的磷酸鹽緩沖液替代。肌原纖維蛋白表面疏水性的計算如公式(3)所示：

(3)

1.3.2.8 SDS-PAGE電泳分析

采用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備凝膠，電泳樣品用樣品溶解液(內含4% SDS，10% β-巰基乙醇，20%甘油，0.02%溴酚藍，0.125 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 6.8)配制成最終質量濃度為5 mg/mL的溶液，漩渦混合1 min，100℃煮沸3 min，于10 000 r/min離心10 min備用。分離膠為12%，濃縮膠為5%，將制好的膠板取下，安裝至電泳槽，上樣量15 μL，MAKER上樣5 μL。開始電流為15 mA，待樣品進入分離膠后改為恒流25 mA，當指示劑遷移至距離膠下端1 cm處關閉電源。染色1 h后脫色12 h，用凝膠系統成像。

1.3.2.9 拉曼光譜分析

取氧化誘導后的肌原纖維蛋白膏，用于拉曼光譜分析。激光波長785 nm，功率120 mW，曝光時間60 s，掃描3次，測試范圍400～3 050 cm-1，測試完成后以苯丙氨酸(1 004 cm-1)為標準進行歸一化，Peakfit擬合分峰；用OMNIC對拉曼光譜數據進行平滑、基線校正。

1.4 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據處理；采用SPSS 19.0統計分析軟件進行方差分析和顯著性檢驗；采用Origin Pro 9.0作圖。所有試驗均做3次重復測定，試驗數據采用平均值±標準差形式。

2 結果與分析

2.1 鹵料提取物的多酚含量

香辛料的抗氧化活性與其多酚含量密切相關，且多酚與蛋白質相互作用會對蛋白質結構和功能特性產生影響[23]。由圖1可知，FC和FS多酚含量分別為35.64、29.09 mg/g，FC多酚含量顯著高于FS(P<0.05)。有研究發現，單一香辛料的丁香醇提物多酚含量低于水提物、桂皮醇提物多酚含量高于水提物[24-25]，表明香辛料提取物的多酚含量隨提取方式的不同而有所差異。香辛料中含有多酚、鞣酸等多酚類物質，可通過清除自由基、螯合金屬離子及還原能力達到抗氧化效果[24]。來源不同的香辛料所含抗氧化物質不同，如丁香中的丁香子酚、姜中的姜黃素、桂皮中的桂皮酚等[8]，其抗氧化效果也有所差異，研究發現，香辛料提取物的抗氧化效果隨著濃度的升高而增加[24]。因此，鹵料提取物的多酚含量受復配比例及提取條件影響，提取工藝仍有待進一步優化。

圖1 不同鹵料提取物的多酚含量

Fig.1 Polyphenol content of different halogen extracts注：不同小寫字母表示不同組間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 鹵料提取物的還原力

在鐵氰化鉀體系吸光度值越高代表著試驗物質的還原能力越強。由圖2可知，FC、FS與0.01% BHT、0.02% BHT的還原力大小順序為0.02% BHT>FC>0.01% BHT>FS，其中0.02% BHT的還原力顯著高于FC、FS和0.01% BHT(P<0.05)，0.01% BHT的還原力顯著高于FS(P<0.05)，但與FC差異不顯著(P>0.05)，表明5 mg/mL的FC和FS的還原力與0.01% BHT相似，因此選擇0.01% BHT為對照進行試驗。

圖2 鹵料提取物與BHT的還原力比較

Fig.2 Comparison of reducing force of brine extracts andBHT

2.3 鹵料提取物對氧化誘導肌原纖維蛋白羰基含量的影響

羰基含量被普遍認為是判斷蛋白氧化程度的指標之一，且蛋白質的氧化程度隨著羰基含量增加而升高[26]。由圖3可知，Ox組羰基含量顯著高于NonOx組(P<0.05)，·OH可與蛋白質直接作用，誘導蛋白質肽鏈斷裂及側鏈基團氧化形成羰基化合物[27]，導致氧化后蛋白質羰基含量升高。Ox+FC、Ox+FS和Ox+0.01%BHT組羰基含量與Ox組相比顯著降低了5.80%、6.16%、4.35%(P<0.05)，顯著高于NonOx組(P<0.05)，但3者之間差異不顯著(P>0.05)。有研究發現[28]，丁香提取物可抑制·OH氧化誘導的豬肉肌原纖維蛋白羰基含量的上升，這與本研究結果相似。香辛料中的多酚含有羥基氫，可與·OH反應，降低蛋白質的氧化程度，從而抑制羰基的生成。因此，鹵料的抗氧化效果與0.01%BHT類似，均可抑制羰基生成。

圖3 鹵料提取物對氧化誘導MP羰基含量的影響

Fig.3 Effect of halogen extracts on the carbonyl content of oxidized myofibrillar protein

2.4 鹵料提取物對氧化誘導肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

由圖4可知，Ox組總巰基含量顯著低于NonOx組(P<0.05)，可能原因是氧化導致埋藏在蛋白質內部的巰基暴露出來，轉化為二硫鍵[29]，或巰基進一步轉化為次磺酸或其他氧化產物[2]。Ox+FC、Ox+FS和Ox+0.01%BHT組總巰基含量均顯著低于NonOx組(P<0.05)，Ox+FC組總巰基含量顯著高于Ox組(P<0.05)，Ox+FS、Ox+0.01%BHT組的總巰基含量高于Ox組，但差異不顯著(P>0.05)，Ox+FC組總巰基含量顯著高于Ox+0.01%BHT組(P<0.05)，但與Ox+FS組差異不顯著(P>0.05)。復合香辛料中的多酚可與MP中的巰基相互作用，形成復合物，從而抑制了巰基的轉化[30]，因此添加復合香辛料組的巰基含量高于Ox組，在本研究中添加FC可減少蛋白質的巰基的轉化，且其效果優于0.01%BHT。

圖4 鹵料提取物對氧化誘導肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

Fig.4 Effects of halogen extracts on total thiols content of oxidized myofibrillar proteins

2.5 鹵料提取物對氧化誘導肌原纖維蛋白表面疏水性、濁度和溶解度的影響

由表1可知，Ox組的表面疏水性和濁度顯著高于NonOx組(P<0.05)，而溶解度顯著低于NonOx組(P<0.05)，出現這種現象的原因可能是氧化使蛋白質分子的表面疏水基團暴露出來，MP的疏水性增加[31];濁度可以反映蛋白質的聚集程度，蛋白質疏水性增加、二硫鍵形成均會導致蛋白質之間發生交聯聚集[32]，使得濁度增加，而蛋白質表面疏水性和濁度的提高會導致其溶解性下降。

氧化誘導后，Ox+FC和Ox+0.01%BHT組的表面疏水性和濁度顯著低于Ox組(P<0.05)，與NonOx組差異不顯著(P>0.05)，且Ox+FC和Ox+0.01%BHT組差異不顯著(P>0.05)。而Ox+FS組的疏水性顯著高于NonOx組(P<0.05)，低于Ox組，但差異不顯著(P>0.05)，濁度高于NonOx組，但顯著低于Ox組(P<0.05)。Ox+FC、Ox+FS和Ox+0.01%BHT組的溶解度均顯著低于NonOx組(P<0.05)，顯著高于Ox組(P<0.05)，且Ox+FC組的溶解度顯著高于Ox+FS和Ox+0.01%BHT組(P<0.05)。賈娜等[33]研究發現0.1%肉桂、丁香提取物可降低蛋白質表面疏水性，改善豬肉糜冷藏過程中蛋白質溶解度的下降，這與本研究的結果相似。與Ox組相比，添加鹵料提取物后，蛋白質的表面疏水性和濁度下降，溶解性提高的原因可能是，鹵料所含多酚的芳香環可以通過疏水作用與蛋白質上的氨基酸疏水性側鏈形成復合物，阻止了疏水性基團的暴露[34]，從而導致可與MP結合的溴酚藍含量減少，降低了MP的疏水性，其聚集程度隨之下降，濁度降低，溶解度提高。綜上所述，添加FC可以明顯降低蛋白質的表面疏水性和濁度，改善蛋白質的溶解度，其抗氧化效果與添加0.01%BHT類似，均優于添加FS。

表1 鹵料提取物對氧化誘導肌原纖維蛋白表面疏水性、濁度和溶解度的影響

2.6 SDS-PAGE電泳分析

肌原纖維蛋白的分子量較為廣泛，肌原纖維蛋白中肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)、肌動蛋白(actin)、原肌球蛋白(tropomyosin)和肌原蛋白(troponin)含量較多，副肌球蛋白(paramyosin)和肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)含量較少。由圖5可知，與NonOx組相比，其余4個組MHC條帶密度明顯減弱，表明氧化后，肌原纖維蛋白的MHC和MLC發生了聚合或降解。

圖5 不同組氧化誘導MP的SDS-PAGE電泳分析

Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis analysis of myofibrillar proteins from different treatment groups

氧化后Ox組明顯沒有MLC條帶，但Ox+FC、Ox+FS和Ox+0.01%BHT組的MLC條帶仍然存在，只是較NonOx組淺，表明鹵料抗氧化效果與0.01%BHT類似，可保護蛋白質，減緩蛋白質的氧化降解。

2.7 鹵料提取物對氧化誘導肌原纖維蛋白拉曼光譜的影響

拉曼光譜的酰胺I帶(1 655±5 cm-1)可以有效反映肌原纖維蛋白的二級結構[35]。由圖6可知，氧化前后，拉曼光譜的酰胺I帶吸收峰強度減弱，且Ox組的酰胺I帶吸收峰較其他組低，說明·OH誘導的氧化可以導致蛋白質二級結構發生變化。從表2可以看出，與NonOx組相比，Ox組的α-螺旋(1 645～1 657 cm-1)含量顯著降低(P<0.05)，β-折疊(1 665～1 680 cm-1)含量顯著增加(P<0.05)。當蛋白發生氧化后，蛋白質的酰胺I帶向長波長移動，α-螺旋解旋而部分轉化成β-折疊，肽鏈重排，蛋白的結構發生變化[36]。由于蛋白的結構緊密程度和構象穩定性大大降低，包埋于分子內部的疏水性殘基暴露出來，增強了肌球蛋白分子間的疏水相互作用，引起蛋白質的聚合[37]，因此氧化后，蛋白質表面疏水性和濁度升高。

圖6 鹵料提取物對氧化誘導MP拉曼光譜的影響

Fig.6 Raman spectroscopic analysis of oxidation inducedmyofibrillar treated by halogen extracts

Ox+FC和Ox+0.01%BHT組的α-螺旋含量均顯著高于Ox組(P<0.05)，低于NonOx組，但差異不顯著(P>0.05)，β-折疊含量均顯著低于Ox組(P<0.05)，高于NonOx組，但差異不顯著(P>0.05)。Ox+FS組的α-螺旋含量顯著低于Ox+FC組(P<0.05)，β-折疊含量則顯著高于Ox+FC組(P<0.05)。多酚在一定程度上可以延緩酰胺I帶的位移，抑制蛋白質結構變化，降低蛋白氧化聚合程度，從表2可知，添加FC與0.01%BHT的效果類似，可以較好的保護α-螺旋結構，減少β-折疊結構的產生，從而降低蛋白質的表面疏水性和濁度，這與上述疏水性和濁度結果一致。

表2 鹵料對氧化誘導MP二級結構含量的影響

3 結論

FC的多酚含量顯著高于FS(P<0.05)。FC和FS均可抑制羰基生成，保護巰基，降低蛋白質的表面疏水性和濁度，提高其溶解度，但FC的抗氧化效果更好。綜合SDS-PAGE電泳及拉曼光譜分析，添加FC比FS更能有效延緩蛋白的酰胺I帶向長波長移動，保護蛋白質的二級結構，能有效抑制蛋白質氧化降解、變性聚集。總的來說，FC的蛋白質抗氧化效果與0.01%BHT類似，優于FS的蛋白抗氧化效果。今后，鹵料的提取工藝有待進一步優化，鹵料提取物的質量濃度對蛋白質的抗氧化效果的影響仍需繼續研究，相應的抗氧化性能及其機理仍需詳細探討，并可以研究對醬鹵肉制品貯藏品質的影響。