基于美拉德反應制備的熟制黑枸杞加工工藝及活性成分變化規律

胡云峰，王曉彬，陳君然*，朱彥華

1(省部共建食品營養與安全國家重點實驗室(天津科技大學)，天津，300457) 2(早康枸杞股份有限公司，寧夏 中寧，755100)

熟制黑枸杞是一種將枸杞(LyciumbarbarumL.)在特定溫、濕度條件下加熱熟制后制成的黑色枸杞產品，是基于美拉德等一系列復雜反應后得到的，不同于天然黑果枸杞。美拉德反應(maillard reaction，MR)是氨基酸或蛋白質中含有的氨基和糖類中的羰基在加熱條件下發生的復雜反應[1-2]，反應過程中會產生大量的中間產物(maillard reaction products，MRPs)，它們不僅可改善產品色澤、風味，還具有多種活性，如抗氧化、抑菌、抗炎等[3-4]。因此，美拉德反應廣泛存在并應用于中藥炮制過程中。中藥素有“生熟異治”的說法，經炮制后的中藥化學成分發生變化，活性成分的增減導致其藥性改變，同時炮制也會賦予其特殊的“藥香”，緩和藥物氣味，這些成分的變化經證明均是由MRPs帶來的[5-6]。

美拉德反應過程中會產生大量的呈色物質，如類黑素等，使產品表現出良好的色澤[7]。同時，美拉德反應產生的復雜的雜環化合物賦予食品獨特的風味[8]。王旭等[9]研究表明，等量的葡萄糖和不同的氨基酸如Gly、Ala、Tyr、Asp、Val、His、Lys、Pro和Phe于180 ℃下反應可產生焦糖香氣、巧克力香氣和特殊的紫羅蘭香氣。除改善產品感官品質外，李芳菲等[10]研究表明，MRPs具有強抗氧化性，能夠抑制脂肪氧化酸敗，保持肉糜鮮亮，延長肉糜保質期。本試驗以枸杞為原料，基于美拉德反應制備熟制黑枸杞，并對其加工工藝及品質變化規律進行相關研究，為枸杞的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍干枸杞：水分質量分數為3%，寧夏中寧早康枸杞股份有限責任公司； PP聚丙烯托盤，天津愷瑞康科技有限公司，規格為25 cm×15 cm×2 cm。

無水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、沒食子酸、NaOH,均為分析純，天津市北方天醫化學試劑廠；苯酚(分析純)，天津市化學試劑三廠；福林酚(生化試劑)，上海索萊寶生物科技有限公司；蘆丁(生化試劑)，天津一方科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DL-101型電熱恒溫鼓風干燥箱，天津市中環實驗電爐有限公司；CR-10型自動測色色差計，柯盛行儀器有限公司；MP522型精密pH/電導率儀，成都銳新儀器儀表有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；PL203/01電子分析天平，特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 熟制黑枸杞制備工藝優化

稱取一定量凍干枸杞，加入枸杞總質量30%的蒸餾水后，均勻放置于托盤中，托盤用塑料膜封口后置于恒溫恒濕箱中，分別于50、60、70和80 ℃條件下熟化處理一定時間，即得到熟制黑枸杞，每隔4 h對MRPs反應程度和褐變度、pH值、色澤以及水分含量進行測定。

1.4 枸杞熟化過程中品質變化規律研究

采用優化的工藝，制備熟制黑枸杞，對熟制過程中的枸杞定期取樣，分析測定活性物質的變化情況。

1.5 指標測定

1.5.1 MRPs反應程度和褐變度測定

采用比色法測定枸杞熟制過程中MRPs和褐變度[11]，每4 h取樣測定。取不同處理時間的熟制黑枸杞粉稀釋適當倍數，溶解、過濾、4 000 r/min離心15 min，測定其上清液在294、420 nm下的吸光度值。

1.5.2 色澤測定

參照賀帆等[12]的方法，用CR-10型自動測色色差計進行測定。每次隨機選取5顆枸杞，在每個枸杞果實的表面取相同位置的點測定亮度L*、紅綠度a*值和黃藍度b*值，結果取平均值。同時按照公式(1)計算枸杞的色差值ΔE。

(1)

式中：ΔE稱為色差值，是描述顏色與標準顏色間差異程度的指標；L*、a*、b*為標準顏色色度值。

1.5.3 水分測定

參照GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法。

1.5.4 pH值測定

取一定質量枸杞按比例添加蒸餾水，溶解，使用MP522型精密pH/電導率測定儀測定pH值，每個樣品平行測定3次，取平均值。

1.5.5 枸杞活性物質測定

參照付艷麗等[13]的苯酚-硫酸法測定枸杞多糖。枸杞中多酚的測定參照陳晨等[14]的紫外分光光度法。黃酮類化合物參照張穎等[15]的比色法進行測定。

1.5.6 感官評價

按照表1對熟制黑枸杞進行感官評價。

表1 感官評價標準

1.6 數據處理方法

采用SPSS 17.0 軟件的one-way ANOVA對重復性試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 熟制黑枸杞制備工藝優化

2.1.1 不同溫度及處理時間對MRPs反應程度的影響

美拉德反應初級階段產生酮類及醛類等小分子化合物，這類化合物在294 nm處有特征吸收峰，因此294 nm的吸光值可反映美拉德反應所生成的MRPs的量，MRPs積累量能反映美拉德反應程度[16]。如圖1所示，各處理組在反應初期，吸光度值均劇烈升高，隨后開始趨于平緩。分析原因主要是反應初期，反應底物充分，迅速產生大量的中間產物(MRPs)，隨著反應底物逐漸被消耗，中間產物生成反應開始趨于停止。

由圖1可見，不同溫度對熟制黑枸杞美拉德反應進程的程度影響不同，加熱溫度為80 ℃時，美拉德反應在12 h已基本結束；而70 ℃時，結束時間為24 h左右，與80 ℃相比，美拉德反應時間延長了12 h。當熟化溫度為60 ℃時，美拉德反應達平穩時間延長至48 h；50 ℃時反應結束時間約為68 h。說明溫度越高，反應速率越快，達到相同吸光度值的時間越短，說明美拉德反應越劇烈。

圖1 處理溫度對MRPs形成的影響

Fig.1 Effect of treatment temperature on content of intermediate products in MRPs

2.1.2 溫度及處理時間對MR褐變度的影響

在美拉德反應過程中，類黑精是末期產生的一類棕褐色高分子物質，在一定范圍內，反應時間越長，類黑精生成量越多，樣品顏色越深，褐變程度隨之加劇，420 nm處的吸光度值可以反映美拉德反應褐變程度[7]。從圖2中可以看出，80 ℃加工條件下，枸杞褐變度升高趨勢最為劇烈，褐變產物生成速度最快，50 ℃加工條件下褐變度升高趨勢最為平緩，褐變產物生成速度最慢，說明黑枸杞熟制過程中美拉德反應隨溫度的升高而加劇，溫度越高，美拉德反應越劇烈，褐變產物生成速度越快。

圖2 處理溫度對美拉德反應體系褐變度的影響

Fig.2 Effect of treatment temperature on content of endproducts in MRPs

2.1.3 溫度及處理時間對熟制黑枸杞pH值的影響

在熟制過程中，由于氨基酸的堿性基團氨基與還原糖的羰基進行縮合，使得游離的氨基基團數量下降，從而體系的pH值不斷下降，因此pH值下降的程度是衡量美拉德反應劇烈程度的一個指標。由圖3可知，體系pH值隨處理時間的延長而不斷降低，在處理初期，pH值下降速率較快，隨著處理時間的延長，pH值下降速率減緩。

圖3 處理溫度對枸杞pH值的影響

Fig.3 Effect of treatment temperature on the pH value of Lycium barbarum L.

80 ℃條件下處理12 h時，pH值已基本穩定，達到4.74，而70 ℃條件下需處理24 h，隨著溫度的下降，達到相同pH值的處理時間增加，50 ℃條件下處理時間需延長至約64 h，是80 ℃條件下的5.3倍左右。隨著反應溫度的升高，反應產物的pH值降低速率明顯加快，說明反應進程隨溫度的升高而不斷加速，這與大量研究結果一致[26-27]。

2.1.4 溫度及處理時間對熟制黑枸杞色澤的影響

美拉德反應產物——類黑精是導致枸杞在干制處理過程中顏色由紅色變為黑色的主要物質，因此可以通過美拉德反應產物的色澤變化，定性判斷美拉德反應程度[19-20]。試驗以L*、a*值和ΔE分析反應程度，由圖4可見，不同溫度條件下枸杞的L*、a*值均隨著時間的延長呈現下降趨勢，ΔE隨著時間的延長呈現上升趨勢。且溫度越高，變化趨勢越明顯。但在熟化處理后期，L*、a*值和ΔE變化趨于平緩，說明類黑精的生成速率趨近于0。

圖4 處理溫度對枸杞色澤的影響

Fig.4 Effect of treatment temperature on the color of Lycium barbarum L.

由各處理組的色差變化趨勢及變化幅度達到較大值的時間，可以推斷出一個有效的反應時間范圍，即 50 ℃，64 h；60 ℃，48 h；70 ℃，24 h；80 ℃，12 h。

2.1.5 溫度及處理時間對熟制黑枸杞水分含量的影響

枸杞屬高水分含量的漿果，在干制初期，過高的溫度會造成枸杞組織內部氣體迅速膨脹，致使組織被壓破，發生開裂現象從而造成產品破損、營養物質流失[30]。如圖5可知，枸杞水分含量隨處理時間的延長而不斷降低。80 ℃條件下枸杞水分含量一直處于較低水平，處理56 h后枸杞內水分含量由32.74%下降到20.40%，下降了12%左右。

圖5 不同處理溫度對枸杞水分含量的影響

Fig.5 Effect of treatment temperature on the moisturecontent of Lycium barbarum L.

與80 ℃相比，枸杞在60和70 ℃條件下熟化處理時，水分含量略高，其中60 ℃干制條件下處理56 h后,水分含量下降到22.38%，已達到干制要求。50 ℃熟化處理時,枸杞水分含量處于較高水平。說明處理溫度對干制過程中枸杞水分含量變化有較大影響，處理溫度越高，枸杞的失水速率越快，達到干制要求所需時間越短。

2.1.6 溫度及處理時間對熟制黑枸杞感官品質的影響

對不同干燥溫度下得到的熟制黑枸杞進行感官評價，結果如表2所示。不同溫度下，熟制黑枸杞感官品質順序為：60 ℃>70 ℃>50 ℃>80 ℃。處理溫度過高時，熟制黑枸杞品質相對較差，這是因為，過高的溫度經美拉德反應制備的熟制黑枸杞苦焦味較重，且色澤不均一，與位錦錦的研究一致[22]。

表2 熟制黑枸杞的感官品質

有研究表明，枸杞初期干燥溫度若高于70 ℃，鮮枸杞易爆裂，加工成的干制品易出現褪色現象，導致成品色澤不均勻[23]。溫度過低時，得到熟制黑枸杞的處理時間延長，能耗增加。因此選擇適當的溫度及熟化處理時間至關重要。60 ℃條件下美拉德反應賦予枸杞獨特的藥香味，使產品具有較好的質地及口感。因此綜合熟制黑枸杞品質和能耗問題，選擇60 ℃熟化效果較好，此時的熟化時間為48 h。

2.2 枸杞熟化過程中活性成分變化規律

2.2.1 枸杞熟化過程中多糖含量變化

枸杞多糖是一種水溶性多糖，隨美拉德反應時間的增加，枸杞多糖含量呈下降趨勢，這是因為美拉德反應是羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質)的反應，反應底物隨時間的延長而逐漸被消耗，導致枸杞多糖含量降低。處理前4 h，枸杞多糖含量下降迅速，由初始的23.75 mg/g下降到19.91 mg/g。4 h后，枸杞多糖含量降低速率減緩，處理至48 h時，枸杞多糖含量為6.01 mg/g，與初始相比，下降了3.95倍。

2.2.2 枸杞熟化過程中多酚含量變化

枸杞熟化過程中，加熱時間越長，枸杞的總酚含量積累越多。

圖6 枸杞熟化過程中多糖含量變化

Fig.6 The change of polysaccharide content of theLycium barbarum L. during ripening reaction注：不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05,下同。

由圖7可知，在整個處理過程中，處理前4 h，枸杞總酚含量上升速度較慢，由10.34 mgGAE/g上升到10.79 mgGAE/g，分析原因可能是在處理前期，枸杞內的多酚氧化酶在60 ℃仍有部分活性，這與文獻報道一致，因此枸杞中的總酚部分被多酚氧化酶催化形成醌及其聚合物[24]。在處理4 h后，枸杞的多酚氧化酶活性大大降低，枸杞總酚含量上升速度加快，最終為22.94 mgGAE/g。

圖7 枸杞熟化過程中多酚含量變化

Fig.7 The change of polyphenols content of theLycium barbarum L. during ripening reaction

在60 ℃干制過程中，枸杞總酚含量呈現上升的趨勢，在這過程中可能會有部分多酚類物質被破壞，但大部分多酚類物質隨著干制過程的進行而積累。

2.2.3 枸杞熟化過程中黃酮含量變化

枸杞黃酮含量隨著處理時間的變化規律如圖8所示,枸杞黃酮含量在整個反應過程中隨著處理時間的延長而上升。在處理0 h時，枸杞黃酮含量僅為1.88 mgRE/g，24 h時黃酮含量為5.25 mgRE/g，處理至48 h時，枸杞黃酮含量上升至8.10 mgRE/g，為反應初始時黃酮含量的4.31倍。因此對枸杞進行熟制處理會使枸杞黃酮含量積累，這與李朋亮等的研究結論一致[34]。

圖8 枸杞熟化過程中黃酮含量變化

Fig.8 The change of flavonoids content of the Lyciumbarbarum L during ripening reaction

3 結論

確定了熟制黑枸杞的最佳熟化溫度和時間：60 ℃熟化48 h。此條件下制備出的熟制黑枸杞果肉較柔軟、厚實，味道酸甜，有獨特的藥香味，口感協調，顏色呈均一的黑色。最佳工藝下熟制黑枸杞內枸杞多糖下降了3.95倍，但多酚類物質與黃酮含量顯著升高，其中多酚類物質在熟化48 h后，升高為熟化前的2.22倍；黃酮含量上升至8.10 mgRE/g，為反應初始黃酮含量的4.31倍。枸杞多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗輻射等作用，但是過量食用會引起上火現象，尤其對于體內有炎癥或易腹瀉的人群不宜過多食用，實驗制備的熟制黑枸杞，雖枸杞多糖含量有所降低，但是多酚類物質與黃酮含量顯著升高，提高了枸杞的抗氧化活性，一定程度上提高了枸杞的附加值。

4 討論

本研究基于美拉德反應制備熟制黑枸杞，將枸杞經過高溫熟化使其充分發生美拉德反應，制備的熟制黑枸杞顏色為均一的黑色，味道酸甜，并具有獨特的藥香味。本試驗在枸杞熟制過程中枸杞多糖含量呈下降趨勢，這是因為美拉德反應是羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質)間的反應，反應底物隨時間的延長而逐漸被消耗，導致枸杞多糖含量降低。美拉德反應不僅賦予產品獨特的風味，而且在反應過程中物質成分會發生變化。王桂欣[26]研究表明，棗粉在熱加工過程美拉德反應產生的類黑精、還原酮類物質在脂質氧化過程中作為電子供體打破自由基鏈式反應并減少氧化中間體，從而達到清除自由基的目的。陳善信等[27]比較了不同炮制品中黃酮的含量變化，結果表明，醋炒槐米和炒槐米均可使黃酮含量增加，炮制過程中，槐米中的一些有機質被破壞而致蘆丁含量相對增加。崔春蘭等[28]研究表明，大蒜在美拉德反應過程中多酚和黃酮含量呈上升趨勢，這些活性物質的增加也促進其抗氧化能力的增強。本試驗中制備的熟制黑枸杞內枸杞多糖含量下降，但多酚類物質與黃酮含量顯著升高，且隨著熟化時間的延長，枸杞內類黑素的積累增加，對枸杞抗氧化活性的提高具有積極影響，與上述研究結果一致。