油莎草總黃酮對牛奶貯藏保鮮作用的影響

翟紅月，王德萍，敬思群

1(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊， 830046) 2(韶關(guān)學(xué)院 英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 韶關(guān)，512005)

油莎草(CyperusesculentusL.)為莎草科莎草屬多年生草本植物，又被稱為油莎豆、人參豆、油莎果、地下板栗等[1]。油莎草原產(chǎn)于非洲地中海沿岸，在含沙60%以上的疏松砂質(zhì)土壤里結(jié)果率可達(dá)90%以上，易于存活[2]。然而，人們對油莎草的開發(fā)利用多集中于油莎豆油，油莎草地上莖葉利用率較低，造成資源浪費(fèi)。

油莎草總黃酮是油莎草長期自然選擇過程中的一類次生代謝產(chǎn)物。絕大多數(shù)黃酮類化合物具有很強(qiáng)的生物活性，可用于藥理研究，如抗氧化作用[3-5]、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用[6]、降血脂作用[7-9]、抑菌作用[10-12]等。油莎草地上莖葉含有黃酮類物質(zhì)，含量可達(dá)13.201 mg/g[13]，且具有很好的抗氧化活性[14]，可促進(jìn)血液微循環(huán)，具有抗凝血作用[15]等。本研究優(yōu)化了油莎草總黃酮的純化工藝，探究油莎草總黃酮的抑菌性，并將其添加到牛乳中，以期為油莎草總黃酮作為天然防腐劑提供科學(xué)理論依據(jù)。這不僅提高了油莎草的附加值，也豐富了食品添加劑市場。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油莎草由新疆克拉瑪依匯利有限責(zé)任公司提供；油莎草總黃酮，實(shí)驗(yàn)室自制(總黃酮提取率為1.46%[16])；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(UV≥98%)，上海源葉生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、NaOH等試劑均為分析純；鮮牛乳，市售。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Eshrichia.coil)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、青霉(Penicillium)、黑曲霉(Aspergillusnige)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)均由新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)(722S型)，上海安亭科學(xué)儀器廠；冷凍干燥機(jī)，德國SIGMA電儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA)，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

(1)吸附實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的大孔樹脂3.00 g，置于50 mL錐形瓶中，加入20 mL，3 mg/mL油莎草黃酮溶液，30 ℃、110 r/min振蕩，每隔2 h測定1次吸附量，并計(jì)算吸附率，總黃酮含量參考敬思群等[17]的方法進(jìn)行測定。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附率為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

(1)

(2)

式中：Q，吸附量，mg/g干樹脂；C1，吸附前總黃酮溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；C2，吸附后溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；W，AB-8大孔樹脂質(zhì)量，g；V，溶液體積，mL。

(2)解吸實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取上述已吸附油莎草總黃酮的飽和樹脂3.00 g，加入70%乙醇溶液15 mL，于30 ℃、110 r/min振蕩，每1 h測定1次解吸量，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，解吸率為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線。

(3)

式中：Q，吸附量，mg/g干樹脂；C3，解吸后溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V，解吸液體積，mL；W，樹脂質(zhì)量，g。

1.3.2 AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

(1)上樣質(zhì)量濃度對AB-8大孔樹脂吸附性能的影響

稱取一定量的總黃酮凍干粉配成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL樣液溶液，各取250 mL在柱床體積為250 mL的AB-8大孔樹脂上進(jìn)行上樣，吸附流速2 BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液無色，收集洗脫液，定容至500 mL，計(jì)算吸附率。

(2)進(jìn)樣速度對AB-8大孔樹脂吸附性能的影響

取總黃酮質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的樣品液250 mL過柱，流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0 BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液無色，收集洗脫液，定容至500 mL，計(jì)算吸附率。

(3)乙醇體積分?jǐn)?shù)對AB-8大孔樹脂洗脫性能的影響

取黃酮質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的樣品液250 mL過柱，吸附流速1BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液無色，再用4倍柱床體積的乙醇洗脫，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%和90%，收集洗脫液，計(jì)算解吸率。

(4)洗脫速度對AB-8大孔樹脂洗脫性能的影響

取總黃酮質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的樣品液250 mL過柱，吸附流速1.0 BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液無色，再用4倍體積的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇以0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，計(jì)算解吸率。

1.3.3 濾紙片法測定油莎草總黃酮的抑菌作用

預(yù)先活化供試菌株，并備好培養(yǎng)基平板，制備菌懸液。參考陳鳳清等[18]的方法將滅菌后的濾紙片分別浸入不同濃度的提取液和無菌水1～3 h。在無菌操作條件下，分別取0.2 mL各種菌懸液加入已制備好的培養(yǎng)基平板中，涂布均勻。用無菌鑷子取浸有提取液的濾紙片貼在含菌平板上，每個(gè)含菌平板貼2片，每組3個(gè)重復(fù)，并用浸有無菌水的濾紙片作對照。貼好濾紙片的平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，最后觀察總黃酮的抑菌效果，并測量抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。

1.3.4 油莎草總黃酮的最小抑菌濃度(MIC)的測定

按照程書朋等[19]的方法并稍作修改，在無菌操作條件下，把質(zhì)量濃度為1 mg/mL的總黃酮母液分別稀釋成50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%的系列溶液。向平皿中分別加入不同質(zhì)量濃度的總黃酮稀釋液各2 mL，然后加入不同供試菌懸液0.2 mL，倒入滅菌后的固體培養(yǎng)基(60 ℃左右)，充分混勻，待完全冷卻凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以菌落不生長的最低濃度為該黃酮對檢測菌的MIC。每個(gè)受試樣平行重復(fù)3次，以不含黃酮的瓊脂板作對照。

1.3.5 油莎草總黃酮對牛乳貯藏的影響

(1)油莎草總黃酮在牛乳中的抑菌效果

取100 mL的鮮牛乳2份，其中1份加入0.2 g油莎草總黃酮，另1份作為空白對照，室溫放置。每隔 24 h采用平板菌落計(jì)數(shù)法按照一定的稀釋梯度稀釋，并涂于固體培養(yǎng)基上，于(36±1)℃培養(yǎng)48 h，測出每板菌落數(shù)。

(2)油莎草總黃酮對牛乳酸度的影響

取300 mL的鮮牛乳6份，加入油莎草總黃酮配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和0.8%的溶液，室溫放置，每隔24 h采用NaOH滴定法測定1次牛乳酸度。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的靜態(tài)吸附及解吸動力學(xué)曲線

圖1 油莎草總黃酮在AB-8大孔樹脂上的吸附動力學(xué)曲線

Fig.1 Adsorption kinetics curve of total flavonoids on AB-8 macroporous resin

由圖1可知，AB-8型大孔吸附樹脂對油莎草總黃酮的吸附趨勢先快速增加，然后逐漸趨于平衡，靜態(tài)吸附起始階段吸附率較大，2 h后增加趨勢變緩，6 h后基本達(dá)到吸附平衡。AB-8型大孔吸附樹脂對油莎草總黃酮具有良好的吸附動力學(xué)特性，適合油莎草總黃酮的分離純化，這與李超等[20]利用AB-8型大孔吸附樹脂純化大葉金花草總黃酮得到的結(jié)果一致。

隨后，對上述吸附油莎草總黃酮達(dá)到飽和的AB-8大孔樹脂進(jìn)行解吸。由圖2可知，靜態(tài)解吸起始階段解吸率不斷增大，隨著時(shí)間的延長曲線變得平緩，解吸率變化緩慢，4 h后達(dá)到解吸平衡。

圖2 油莎草總黃酮在AB-8大孔樹脂上的解吸動力學(xué)曲線

Fig.2 Desorption kinetics curve of total flavonoids on AB - 8 macroporous resin

2.2 AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

2.2.1 上樣濃度對AB-8大孔樹脂吸附性能的影響

由圖3可以看出，隨著油莎草總黃酮質(zhì)量濃度的增加，吸附率逐漸減小，低質(zhì)量濃度有利于總黃酮的吸附，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.5～1.5 mg/mL時(shí)，吸附較為充分，吸附率均高于90%，綜合考慮時(shí)間等因素，選取1.0 mg/mL為最佳進(jìn)樣質(zhì)量濃度。

圖3 上樣質(zhì)量濃度對AB-8大孔樹脂吸附性能的影響Figure 3 Effect of concentration of the original solution on adsorption properties of AB-8 macroporous resin

2.2.2 進(jìn)樣速度對AB-8型大孔樹脂吸附性能的影響

由圖4可以看出，AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的吸附率隨著進(jìn)樣速度的增加而急速減小，原因可能是流速加快之后導(dǎo)致總黃酮與樹脂的接觸時(shí)間變少，且容易導(dǎo)致進(jìn)樣管的堵塞，使吸附率減小，這與孟憲軍等[21]研究AB-8大孔樹脂對藍(lán)莓花色苷的吸附結(jié)果一致，而當(dāng)進(jìn)樣速度為1.0 BV/h時(shí)，吸附率最高，故取1.0 BV/h為最適進(jìn)樣速度。

圖4 不同進(jìn)樣速度對AB-8大孔樹脂吸附性能的影響

Fig.4 Effect of flow velocity on adsorption properties of AB-8 macroporous resin

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對AB-8大孔樹脂洗脫性能的影響

由圖5可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的解吸率先增加后減小，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，解吸率較高，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于 70%時(shí)，解吸率呈下降趨勢。可能是由于不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性大小不同[22]，而體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇的極性和油莎草總黃酮的極性更加接近，使其更容易洗脫下來，并且過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)，會降低提取出的總黃酮純度，因此選擇體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為最佳洗脫劑。

圖5 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對AB-8型大孔樹脂洗脫性能的影響

Fig.5 8 Effect of the ethanol concention on desorption properties of AB-8 macroporous resin

2.2.4 洗脫速度對AB-8型大孔樹脂洗脫性能的影響

由圖6可以看出，AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的解吸率隨著洗脫速度的增加而逐漸減小，當(dāng)洗脫速度為0.5 BV/h時(shí)，解吸率較高，但由于洗脫速度過小導(dǎo)致耗時(shí)較長，且對洗脫劑的浪費(fèi)較為嚴(yán)重；洗脫速度為2.5 BV/h時(shí)，解吸速率快，但解吸率最低；洗脫速度為1.5 BV/h時(shí)，解吸率較高，且沒有明顯拖尾現(xiàn)象，故選擇1.5 BV/h為最佳洗脫速度。

圖6 不同洗脫速度對AB-8大孔樹脂洗脫性能的影響

Fig.6 Effect of desorption velocity on desorption properties of AB-8 macroporous resin

2.3 油莎草總黃酮的抑菌作用

油莎草總黃酮的抑菌作用如表1所示，其對細(xì)菌有較好的抑制作用，尤其是革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，其中油莎草總黃酮對金黃色葡萄球菌的抑菌圈可達(dá)(13.3±0.3) mm；油莎草總黃酮對酵母菌有一定的抑制作用，抑菌圈直徑為(8.8±0.5) mm，但對黑曲霉和青霉的抑菌效果不明顯。

表1 油莎草總黃酮對試驗(yàn)菌抑菌圈大小的影響 單位：mm

注：-表示無抑菌圈;+表示抑菌圈不明顯。

由表2可知，油莎草總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抑菌效果成正相關(guān)，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，抑菌作用越強(qiáng)，這與魏珂等[23]研究苦瓜籽黃酮的抑菌效果一致。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC值均為 6.25%，大腸桿菌的MIC值為12.5%；與細(xì)菌相比，油莎草總黃酮對真菌抑菌效果不明顯，其中酵母菌的MIC值為25%，對霉菌的抑菌效果不明顯。

2.4 油莎草總黃酮對牛乳貯藏的影響

2.4.1 油莎草總黃酮對牛乳中微生物的抑制作用

由圖7可知，隨著時(shí)間的增加，牛乳中微生物的總菌數(shù)呈上升趨勢，常溫放置7 d后，添加了油莎草總黃酮的牛乳中菌落總數(shù)相比空白牛乳中的菌落總數(shù)減少了約60%，且隨著對試樣稀釋比例的增加，菌落總數(shù)急劇下降，初步表明添加油莎草總黃酮對牛乳中微生物的具有一定的抑制作用。

表2 油莎草總黃酮的MIC

注：-表示無菌生長；+表示有少量菌體生長；++表示有不超過 1/3平皿面積的菌落生長；+++表示有不超過1/2平皿面積的菌落生長；++++表示有超過1/2平皿面積的菌落生長。

圖7 牛乳中微生物的總菌數(shù)測定

Fig.7 Determination of total microorganism in milk

2.4.2 油莎草總黃酮對牛乳酸度的影響

總酸度是評價(jià)牛乳新鮮度的重要指標(biāo)，牛乳擠出后，在存放過程中由于微生物的活動，分解乳糖產(chǎn)生乳酸，使牛乳總酸度升高。由圖8可知，添加油莎草總黃酮的鮮乳總酸度的變化相對較小，且隨著油莎草總黃酮添加量的增加，牛乳總酸度變化越小，這與項(xiàng)昭保等[24]研究野生橄欖黃酮對牛奶保鮮作用的結(jié)果一致。常溫放置7 d后，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的油莎草總黃酮的牛乳總酸度相比空白鮮乳降低了50%，證實(shí)了其對牛乳中微生物的活動起到抑制作用，而且油莎草總黃酮的抑菌作用與其質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正相關(guān)。因此，將油莎草總黃酮作為天然防腐劑應(yīng)用于牛乳保鮮中具有一定的推廣意義，可以提高油莎草的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，油莎草總黃酮在牛乳保鮮中的最適添加量、溫度等條件還需進(jìn)一步探討。

圖8 油莎草總黃酮對牛乳酸度的影響

Fig.8 Effect of total flavonoids on milk acidity

3 結(jié)論

AB-8大孔樹脂純化油莎草總黃酮的最佳工藝為進(jìn)樣速度1.0 BV/h、進(jìn)樣質(zhì)量濃度1.0 mg/mL，洗脫劑最適宜體積分?jǐn)?shù)70%、洗脫速度1.5 BV/h，在此條件下，總黃酮最高解吸率可達(dá)(94.72±1.21) %。純化后純度為(32.63±0.61) %，相比純化前提高了約3.5倍。油莎草總黃酮對細(xì)菌有較好的抑制作用，尤其對革蘭氏陽性菌抑制效果更佳，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌MIC值可達(dá)6.25%，對霉菌的抑菌效果不明顯。此外，添加油莎草總黃酮的鮮牛乳置于常溫7 d后，與空白鮮牛乳相比，其菌落總數(shù)減少了60%、牛乳總酸度降低了50%，且隨著油莎草總黃酮濃度的增加，牛乳酸度變化幅度越小。