紅葡萄酒中花色苷的超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜檢測方法建立

陳欣然, 張波, 張歡, 解迎雙, 王波, 周小平, 李敏, 韓舜愈*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730700) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室(甘肅農業大學)，甘肅 蘭州，730700) 3(甘肅出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫綜合技術中心，甘肅 蘭州，730000)

顏色是評價葡萄酒質量優劣的重要指標之一，花色苷作為顏色的物質基礎，在其中發揮著重要的作用。檢測發現，花色苷是一類多酚類物質，作為一種安全性高的天然色素已在食品、醫藥、化妝品等領域有廣泛應用[1]。紅葡萄酒中的花色苷可以從葡萄果皮中浸漬而來，并在生產和貯藏中轉化形成以花色苷及其衍生物為主要類型的花色苷體系，從而影響葡萄酒的色澤[2]。這其中花翠素(delphinidin，Dp)、花青素(cyanidin，Cy)、3’-甲基花翠素(petunidin，Pt)、3’-甲基花青素(peonidin，Pn)和3’, 5’-二甲花翠素(malvidin，Mv)的3-O-單葡萄糖苷形式和其?；问?乙?；?、p-香豆酰基和咖啡酰基等)的衍生物是葡萄和葡萄酒中主要的花色苷[3]。

近年來，由于缺乏花色苷標準品，導致可準確鑒定的花色苷數量有限。因此，建立高靈敏度、高準確度的花色苷分析方法越來越受到人們的關注。目前，國外對葡萄及葡萄酒中花色苷物質及其衍生物的鑒定研究比較成熟[4-5]，但國內對葡萄及葡萄酒中花色苷的研究卻主要集中在對總花色苷的提取及含量測定方面，其中紫外分光光度法最為常見[6]，而對花色苷的定性鑒定則多采用液相色譜技術[7-8]。超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜(ultra-high performance liquid chromatography tandem triple quaternary mass spectrometry，UPLC-ESI-QQQ)技術是近年來發展起來的一項新的天然產物有效成分定性定量分析方法，可以在缺少標準品的情況下對提取物中微量成分進行結構分析，具有靈敏度高，選擇性強，分析快速，定量重現性好等特點，是目前最受關注的分析檢測技術。

本研究以紅葡萄酒為材料，以UPLC-ESI-QQQ為檢測方法，通過不同洗脫程序選擇最佳方案，建立超高效液相色譜(UPLC)技術檢測葡萄酒花色苷的分析方法，進一步采用UPLC-ESI-QQQ技術，判斷花色苷結構類型，為深入研究葡萄及葡萄酒中色素種類提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣：本實驗室自釀的紅葡萄酒樣品：美樂干紅葡萄酒(2017年)、赤霞珠桃紅葡萄酒(2017年)、混釀干紅葡萄酒(2017年)。將1 mL紅酒樣品直接注入0.45 μm無機膜(聚醚砜)過濾，然后分析。

標準品：花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、3’-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、3’-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷(美國Miragen公司，純度均≥98.0%)。

試劑：甲酸(分析級)、乙腈(色譜級)、甲醇(色譜級)、水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.2 儀器

Agilent 1290系列UPLC(G1316C二元高壓梯度泵，G4226A自動進樣器，G4220A柱溫箱)；Agilent 6460型三重四級桿質譜；SK8200H型超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；OFO-945601型渦旋混合器，美國Talboys公司；CP224S型分析天平，德國Sartorius公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

將購得的標準品分別用2%甲酸甲醇溶解，然后轉移至5 mL容量瓶中定容，配制成100 mg/L的標準儲備液，保存于-20 ℃。根據試驗情況，再把標準儲備液稀釋成不同質量濃度的工作液。

1.3.2 色譜條件

參考LI[9]的方法并略有改動。色譜柱：Poroshell 120 EC-C18柱(150 mm×2.1 mm，2.7 μm；Agilent Technologies)；進樣體積：3 μL；流動相A(V(甲酸)∶V(水)=0.2∶100)，流動相B(V(甲酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=0.2∶50∶50)；柱溫：30 ℃。具體的梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 質譜條件

ESI離子源溫度350 ℃；正離子模式；霧化器壓力35 psi；干燥氣流速12 L/min；干燥氣溫度350 ℃；m/z掃描范圍100～1 000。

1.3.4 花色苷成分的定量分析

以標準物質3’,5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為標準，對其進行相關外標定量，質量濃度梯度為0～50 mg/L，9個水平，其他花色苷以相當于3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計。

1.4 數據分析

統計分析由安捷倫質譜亨特工作站軟件版本b.04.00數據采集和處理。

2 結果與分析

2.1 花色苷分析方法的建立

2.1.1 色譜柱的選擇

本試驗首先使用葡萄及葡萄酒中5種基本花色苷標準品建立液相方法。花色苷作為極性化合物，易溶于水、甲醇和乙腈等極性溶劑[10]，我們通常采用非極性固定相和極性流動相的反相色譜法分析花色苷。首先選擇用Zorbax SB C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)色譜柱對其進行分離。當甲酸調節流動相pH為1.5時，鍵合相會逐漸水解，降低柱效，造成峰展寬，保留時間長，并且存在拖尾現象，影響本試驗對5種花色苷的準確定性和定量。而Poroshell 120 EC-C18(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)色譜柱有較強的耐酸性，可在pH 1.5條件下重復進樣，縮短了保留時間，獲得了良好的峰形、優異的重現性。該色譜柱為亞3 μm填料和表面多孔層，顆粒分布度小，柱效高。其多孔層和實心核的特點限制了擴散距離，提高了花色苷物質的分離速度，而窄粒徑分布則提高了柱效和分離度，實現了花色苷物質的快速、高效分離[11]。

2.1.2 流動相的選擇

在分離的反相系統中，常采用混合水相和有機相作為流動相，并隨著時間改變流動相的洗脫能力，從而改變被測組分的相對保留值[12]。由于花色苷類物質結構類似，不能通過改變溶劑強度而增加分離度，而當有機相為甲醇、乙腈(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)時，花色苷物質響應更高且噪音更低。此外，pH較高時(pH>2.5)，由于花色苷中常有的烊陽離子形式存在干擾[3]，導致色譜峰加寬。為了避免這種現象發生，本試驗選擇甲酸調節pH環境至1.5水平，在此條件下對花色苷進行分離，并進行準確定量。另外，在ESI+模式下，甲酸還可以提供H+，提高了花色苷的離子化效率[13]。因此，當以V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1為有機相，并加入0.2%甲酸時，樣品中花色苷分離度、重現性均較好，得到了理想的分離效果。

2.2 方法學評價

2.2.1 標準曲線及線性范圍的確定

取高于定量下限不同濃度的含花色苷混合標準液，配成9個不同質量濃度的標樣，每個水平點重復操作3次，進樣分析，分別獲得各自的峰面積，通過建立樣品質量濃度與峰面積的標準曲線，計算其回歸方程，并計算相關系數R2。考慮到進樣質量濃度太高，質譜響應值將過大，超過儀器所能響應的上限會導致質量數不準確，因此，檢測樣品時將通過稀釋相關倍數，使質量濃度在線性范圍之內。

由表2可知，5種花色苷標準曲線線性回歸方程的R2在0.99以上，各方法檢出限較低(0.001～0.010 mg/L)，表明該方法對花色苷檢測有較高的靈敏度。

表2 五種花色苷回歸方程及相關系數

2.2.2 精密度及回收率試驗

分別以0.02、0.04、0.06 mg/L三個質量濃度為添加水平，每個水平重復6次，在已知花色苷含量的葡萄酒樣中添加相應質量濃度的5種基本花色苷標準溶液，室溫靜置30 min后，按照1.3.2和1.3.3方法測定葡萄酒中5種花色苷含量，結果見表3。由表3可知，回收率為83.38%～118.71%，表明該方法準確度較高。日內精密度與日間精密度RSD分別為0.62%～1.70%，2.13%～3.90%，表明日內與日間有良好的穩定性，可用于葡萄酒中花色苷的定量分析。

表3 精密度及添加回收率(n=6)

2.3 花色苷物質結構鑒定

在QQQ儀器中，Q1和Q3為兩掃描四極模塊，在其之間，包含有Q2模塊，作為碰撞池結構。選擇性離子檢測(selected ion monitor)即單離子監測(single ion monitor)掃描方式，對于已知化合物，為了提高某個離子的靈敏度，并排除其他離子的干擾，Q1只允許目標離子通過，而其他離子不被記錄，Q2碰撞單元產生碎片離子，Q3只分析一個碎片離子。[M+H]+為花色苷的分子離子，可以利用不同的毛細管電壓掃描固定[M+H]+，根據各離子在不同電壓下碎裂的相應豐度找出最佳的碰撞誘導解離電壓。而在碎片離子掃描模式下找出最佳的碰撞能量，以及各化合物的碎片離子。優化好分子離子解離電壓和碎片離子碰撞能量后，采用多反應監測(MRM)模式檢測葡萄酒中目標花色苷。

源于葡萄原料中的花色素的單葡萄糖苷、乙?；咸烟擒铡⑾愣辊；咸烟擒找约翱Х弱；咸烟擒?，分別通過丟失一個葡萄糖、乙?；咸烟?、香豆酰化葡萄糖和咖啡?；咸烟?，產生[M-162]+、[M-204]+、[M-308]+和[M-324]+特征性碎片離子，而在葡萄酒發酵和陳釀過程中形成的4位乙烯甲酸、乙烯基兒茶酚、乙烯基苯酚等衍生物，由于4位上基團比較穩定，在ESI-QQQ的正離子模式下不發生裂解，僅從3位上丟失葡萄糖、乙酰化葡萄糖、香豆?；咸烟呛涂Х弱；咸烟悄阁w，產生相應的[M+A-162]+、[M+A-204]+、[M+A-308]+、[M+A-324]+的特征性碎片離子(A為4位上縮合的基團分子量)。

花色苷的極性不同，其洗脫順序也不同[9,14]。其洗脫規律可總結為：(1)對于具有相同取代基的花色苷，洗脫順序為花翠素、花青素、3’-甲基花翠素、3’-甲基花青素、3’, 5’-二甲花翠素；(2)對于其?；ㄉ障疵擁樞驗椋悍酋；⒁阴；?、香豆?；?、咖啡?；?。其中，香豆?；樖疆悩嬻w較反式異構體洗脫時間早，這與之前報道相一致[15-16]。研究表明，出現香豆酰化花色苷的順式異構體，是葡萄皮經過陽光照射的緣故[16-17]；(3)對于吡喃型花色苷，其洗脫順序為乙烯基甲酸，乙醛，丙酮，4-乙烯基鄰苯二酚，4-乙烯基苯酚，4-乙烯基愈創木酚等。

依據花色苷母離子、子離子質譜信息并結合其洗脫規律，可推測出花色苷類物質，如表4所示。

表4 花色苷物質譜信息表

續表4

序號化合物母離子(m/z)碎裂電壓/V子離子(m/z)碰撞能量/V保留時間/min424-乙烯苯酚3’, 5’-二甲花翠素香豆?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Mv-3-O-coumaroylglu7551054473027.427434-乙烯愈創木酚花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Dp-3-O-glu6111034493024.005444-乙烯愈創木酚3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Mv-3-O-glu6391354771924.665454-乙烯愈創木酚花翠素香豆?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Dp-3-O-coumaroylglu7571054492527.425

注：glu為glicoside的縮寫。(下同)。

2.4 花色苷物質含量分析

利用上述建立的優化技術檢測來自本實驗室自釀的美樂干紅葡萄酒(2017年)、赤霞珠桃紅葡萄酒(2017年)、黑比諾赤霞珠美樂混釀干紅葡萄酒(2017年)3種酒樣，從其中共鑒定出45種花色苷類物質(表5)。

表5 不同葡萄酒樣中花色苷含量以Mv-3-O-glu計)

續表5

序號化合物品種(均為2017年葡萄酒)赤霞珠桃紅美樂干紅混釀干紅324-乙烯兒茶酚3’-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylcatechol adduct of Pt-3-O-glu0.01±0.520.25±0.300.21±0.94334-乙烯兒茶酚3’-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷4-vinylcatechol adduct of Pn-3-O-glu0.04±0.960.54±0.610.54±0.79344-乙烯兒茶酚3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylcatechol adduct of Mv-3-O-glu0.42±0.993.45±0.803.96±1.00354-乙烯兒茶酚花青素乙?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylcatechol adduct of Cy-3-O-acetylgluTrace0.10±0.570.10±0.84364-乙烯兒茶酚3’-甲基花翠素香豆?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylcatechol adduct of Pt-3-O-cou-maroylgluND0.01±0.640.01±0.81374-乙烯苯酚3’-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Pn-3-O-glu0.03±0.910.18±0.960.18±0.87384-乙烯苯酚3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Mv-3-O-glu0.96±0.625.06±0.804.30±0.93394-乙烯苯酚花翠素乙?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Dp-3-O-acetylgluTrace0.01±0.860.01±0.94404-乙烯苯酚3’-甲基花青素乙?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Pn-3-O-acetylglu0.01±0.870.18±0.410.13±1.00414-乙烯苯酚3’, 5’-二甲花翠素乙酰化-3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Mv-3-O-acetylglu0.15±0.422.37±0.511.58±0.78424-乙烯苯酚3’, 5’-二甲花翠素香豆酰化-3-O-葡萄糖苷4-vinylphenol adduct of Mv-3-O-coumaroylglu0.01±0.950.47±0.480.31±0.98434-乙烯愈創木酚花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Dp-3-O-glu0.05±0.840.25±0.630.21±0.62444-乙烯愈創木酚3’, 5’-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Mv-3-O-glu0.15±0.800.29±0.740.29±0.44454-乙烯愈創木酚花翠素香豆?；?3-O-葡萄糖苷4-vinylguaiacol adduct of Dp-3-O-coumaroyl-gluTrace0.02±0.770.01±0.86

注：Trace，痕量；ND，未檢測到。

從表5中可以看出，無論是從種類還是含量的分布上，主要以源自葡萄的5種花色素葡萄糖苷、花色素乙?；咸烟擒占盎ㄉ叵愣辊；咸烟擒諡橹鳎鴮εc在葡萄酒發酵和陳釀過程中形成的衍生物，盡管在部分酒樣中只被少量的檢測到，但它們對葡萄酒口味的改變起著重要的作用。

3 結論

本試驗在色譜柱Poroshell 120 EC-C18柱(150mm × 2.1 mm，2.7 μm)，流動相A：V(甲酸)∶V(水)=0.2∶100，流動相B：V(甲酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=0.2∶50∶50色譜條件下，以葡萄和葡萄酒中5種基本花色苷為標準，建立了花色苷分析方法。采用UPLC-ESI-QQQ技術，結合MRM多反應監測，在28 min內從不同的葡萄酒樣品中準確鑒定出45種花色苷及其衍生物。本方法簡單、快速，直接可用于對花色苷類物質的準確定性、定量分析。