β-半乳糖苷酶的微生物細胞表面展示及其應用

蔣曉敏，王賀，王允祥,，錢永常，尹良鴻，范麗

1(浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 杭州，311300) 2(浙江農林大學 暨陽學院，浙江 紹興，311800) 3(浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州，311300)

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23 β-galactosidase)不僅能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖，也會發生轉糖苷反應產生非消化性的低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)，具水解和轉糖苷雙重活力。因此，該酶廣泛應用于食品工業、醫學和生化分析等領域。目前，商用β-半乳糖苷酶的主要生產方式是微生物發酵[1]，且多呈游離態。但游離的β-半乳糖苷酶存在提純過程繁瑣、傳質阻力大等缺陷。雖然固定化酶技術在一定程度上有所改進，但固定化仍要提供純化的酶源，還有固定化過程會造成大量的酶損失和活性降低等問題，因而限制了β-半乳糖苷酶在工業上的進一步應用。

近年來，微生物細胞表面展示技術的迅速發展為β-半乳糖苷酶的研究提供了新的視角。微生物細胞表面展示技術的基本原理是通過DNA重組技術把外源蛋白或多肽基因與宿主特定的錨定蛋白基因融合導入宿主中，利用該錨定蛋白的定位作用從而將外源蛋白或多肽固定化表達在細胞表面[2]。利用微生物細胞表面展示技術將β-半乳糖苷酶定位展示在細胞表面，不但省去了復雜的分離純化和固定化操作，而且展示在細胞表面的β-半乳糖苷酶顯示出優良的穩定性和有機溶劑耐受性[3]。

由于β-半乳糖苷酶是由4個亞基組成的四聚體蛋白，相對分子質量較大。鑒于此，該展示系統宿主的研究主要集中于乳酸菌、酵母、芽孢這3類。本文將綜述不同宿主中β-半乳糖苷酶表面展示系統及其應用的進展。

1 不同的β-半乳糖苷酶微生物細胞表面展示系統

根據宿主的不同，β-半乳糖苷酶微生物細胞表面展示系統可分為乳酸菌細胞表面展示、酵母細胞表面展示和芽孢表面展示(表1)。

1.1 β-半乳糖苷酶的乳酸菌細胞表面展示系統

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是將活性分子傳遞到黏膜組織的理想載體，有些菌株具有益生菌的特性，被世界衛生組織公認為是安全的。構建乳酸菌表面展示系統需要有信號肽和錨定結構域基本元件。目標蛋白可以與跨膜蛋白或脂蛋白重組共價錨定在細胞膜上，或者利用被分選酶識別的保守基序(Leu-Pro-X-Thr-Gly，LPxTG)以共價或通過表層蛋白(S層蛋白)、自溶素基序(Lysine motif，LysM)結構域等非共價結合到細胞壁上[4]，見圖1所示。

表1 β-半乳糖苷酶微生物細胞表面展示系統

圖1 乳酸菌細胞表面展示系統

Fig.1 Methods for target protein display in LAB using different anchor proteins

由于β-半乳糖苷酶是大分子蛋白，圖1中跨膜蛋白、脂蛋白、LPxTG基序3種表面展示模型都需要目標蛋白穿越細胞膜與細胞壁，這一過程極有可能導致蛋白無法正確折疊或者無法正常分泌。所以，目前在乳酸菌表面展示β-半乳糖苷酶的策略主要集中在S層蛋白和內溶素的LysM重復序列這2種體外展示機制。S層蛋白是乳酸菌細胞壁上的表層蛋白，通常包含2個功能區域：細胞壁結合區和自組裝區。細胞壁結合區主要利用該部分的堿性氨基酸與帶負電荷的細胞壁次級聚合物之間的相互作用來介導細胞壁結合。自組裝區則能在不受融合模塊影響的同時將功能序列展示在S層蛋白最外層表面上[5]。這2個特殊功能區域使得β-半乳糖苷酶這類大分子蛋白展示在乳酸菌細胞表面成為可能。

目前，以LAB作為β-半乳糖苷酶的展示宿主主要有2種策略，一是目標蛋白與LAB錨定蛋白融合后經E.coli表達后，通過體外吸附方式固定在由三氯乙酸處理得到的LAB靜息細胞表面；另一種方式是利用熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)纖維小體中的黏附模塊(Cohesin)與錨定蛋白融合而固定在LAB細胞表面，目標蛋白與對接模塊(Dockerin)進行融合表達使目的酶基因攜帶對接模塊的分子標簽，然后通過黏附模塊和對接模塊之間的特異性相互作用，引導帶有對接模塊分子標簽的β-半乳糖苷酶定量地展示在LAB細胞表面(圖2)。HU等[6]利用卷曲乳桿菌(LactobacilluscrispatusK2-4-3)的S層蛋白(SlpB)的C端區域(LcsB)作為錨定基序，以N-端融合方式與類芽孢桿菌(Paenibacillussp. K1)β-半乳糖苷酶基因重組，在E.coliOrigami B (DE3)胞內表達獲得含融合蛋白的細胞裂解物，在37 ℃、1 h條件下與經過化學物質處理的Lactococcuslactis、Lb.crispatus、Lactobacillusbrevis、Lactobacillusdelbrueckii、Lactobacillushelveticus等乳酸菌靜息細胞進行體外吸附結合試驗，發現該酶可成功錨定在上述乳酸菌細胞表面，并檢測到一定量的酶活。有意思的是，但卻無法通過基因重組技術以體內方式將β-半乳糖苷酶固定在乳酸菌細胞表面，推測可能與該酶在展示表達過程中無法正確折疊或分泌效率極低有關。該課題組[7]也根據LysM序列能與肽聚糖和甲殼素非共價結合這一特性[8]，將類芽孢桿菌β-半乳糖苷酶基因與發酵乳桿菌(LactobacillusfermentumK37)溫和噬菌體фPYB5內溶素(Ly5C)基因構建融合蛋白，以體外方式成功展示在L.lactis、Lb.brevis、Lactobacilluscasei和Lactobacillusplantarum等乳酸菌細胞表面，但表現出的活性顯著低于LcsB構建的。此外，XU等[9]以植物乳桿菌細胞壁蛋白MurO為錨定蛋白成功將兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidium)β-半乳糖苷酶定位在活的Lb.plantarum細胞表面。從這些研究結果可知，對β-半乳糖苷酶進行乳酸菌細胞表面展示更多地是采用體外吸附展示策略，但這一策略不僅要提供融合有錨定蛋白的β-半乳糖苷酶酶液，還需要在吸附結合前對乳酸菌細胞進行誘導處理，且目標酶蛋白易于脫落。

A-通過體外吸附方式展示在LAB細胞表面；B-利用“Cohesin-Dockerin”特異性相互作用原理展示在LAB細胞表面圖2 β-半乳糖苷酶乳酸菌細胞表面展示策略

Fig.2 Schematic representation of strategies for β-gala- ctosidase surface display in LAB

圍繞著如何提高β-半乳糖苷酶的展示效率，研究者們亦開發了一些新型乳酸菌表面展示系統。WIECZOREK等[10]利用熱纖梭菌纖維小體中的對接模塊和黏附模塊相互作用原理，把E.coliMG1655的β-半乳糖苷酶融合到1型或2型的對接模塊，再與展示在L.lactishtraNZ9000細胞表面的1型或2型黏附模塊蛋白結合，從而將β-半乳糖苷酶復合物成功展示在乳酸菌細胞表面，且1型的酶活達到1.4×10-8μmol/L PNP/min/cell，約為2型的2倍。研究表明，β-半乳糖苷酶的分子尺寸、結合順序、在支架內的位置不同所對應的酶活確實存在差異，這為探索β-半乳糖苷酶表面展示領域提供了有價值的參考。

1.2 β-半乳糖苷酶的酵母細胞表面展示系統

與乳酸菌非共價結合β-半乳糖苷酶的展示方式不同，酵母細胞表面展示系統擁有真核宿主分泌表達的優良特性，能促進β-半乳糖苷酶正確折疊和有效分泌，不需要額外的純化和固定化步驟[11]。β-半乳糖苷酶的酵母細胞表面展示系統由β-半乳糖苷酶、錨定蛋白、連接肽、酵母細胞4個基本元件組成，其中已報道的錨定蛋白有α-凝集素和Pir蛋白(圖3)。

圖3 β-半乳糖苷酶酵母細胞表面展示系統

Fig.3 Cell surface display of β-galactosidase in yeast

β-半乳糖苷酶與錨定蛋白彼此間通過一小段連接肽組成融合蛋白，利用錨定蛋白與細胞壁的結合結構域成功展示在酵母細胞表面。目前，α-凝集素是釀酒酵母細胞表面展示體系中最常用的錨定蛋白[12]。LI等[13]將擴展青霉(PenicilliumexpansumF3)β-半乳糖苷酶編碼基因(bgaF3)與α-凝集素Aga2亞基的C端融合，然后通過以二硫鍵共價結合的Aga1p而固定表達在釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeEBY-100)細胞表面，免疫熒光顯微鏡和酶活測定結果確證了β-半乳糖苷酶的成功展示。

此外，有學者利用解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)細胞壁蛋白Pir作為錨定蛋白用來展示米曲霉(Aspergillusoryzae)β-半乳糖苷酶[14]。該研究小組還發現，當以乳糖作為碳源時可篩得具有較高赤蘚糖醇合成能力的重組子，而且引入的2個組成型啟動子FABIN和hp4d在增強β-半乳糖苷酶誘導表達水平方面無顯著差異。

1.3 β-半乳糖苷酶的芽孢表面展示系統

作為一種新型的微生物表面展示系統，芽孢表面展示技術以其獨特的形成機制和理化特性賦予了外源蛋白特殊的展示過程和優良的抗逆性，并在相對分子質量高的多聚體蛋白生產、疫苗制備、工業用酶生產等方面展現出眾多優勢和巨大應用潛力，日益成為國內外科研人員研究的熱點[15-17]。在芽孢桿菌屬中，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)因其清晰的遺傳背景、成熟的表達系統以及食用安全性等優勢，使之成為進行芽孢表面展示的理想平臺。推測的芽孢表面展示過程見圖4所示[17]。

藍色-錨定蛋白；紅色-目標蛋白圖4 推測的芽孢表面展示過程示意圖

Fig.4 Schematic of a possible process for the development of spore-surface display

由圖4可知，外源目的蛋白編碼基因與含有自身啟動子的錨定蛋白基因融合，得到融合基因表達載體，之后轉入芽孢桿菌胞內，經誘導培養后，融合基因在孢子母細胞內表達，并通過錨定蛋白的定位而完成在芽孢表面的附著，最后母細胞裂解釋放出成熟的芽孢。近年來，圍繞如何提高枯草芽孢桿菌芽孢表面展示效率進行了大量研究，提出了選擇合適的錨定蛋白，引入誘導型啟動子和適宜的linker調控表達，增加外源基因拷貝數，敲除部分高豐度、非必須型衣殼蛋白編碼基因等策略。

由于芽孢外層的衣殼蛋白的特性，使得芽孢對惡劣環境具有高度抵抗能力，并且具有長時間保持休眠的能力。這一特性使得融合蛋白的熱穩定性、有機溶劑耐受性等得以提高。有研究表明[18]，β-半乳糖苷酶的芽孢表面展示系統中芽孢的存在不但不影響酶的最適pH和溫度，而且還保護被吸附的β-半乳糖苷酶不受酸性pH條件的影響。相比于乳酸菌、酵母等展示系統要求目標蛋白穿過細胞膜，芽孢結構比較特殊無細胞膜結構，克服了目標蛋白折疊不正確和定位不準確等問題[15]。這一特殊機制使得β-半乳糖苷酶這類大分子蛋白在芽孢表面高效表達成為可能。

一般地，芽孢表面展示體系分為重組型芽孢表面展示體系、非重組型芽孢表面展示體系和無錨定蛋白型芽孢表面展示體系。近年來，開展β-半乳糖苷酶重組型芽孢表面展示的研究很多，已報道的錨定蛋白有CotB、CotC、CotE、CotG、CotX、CotY、CotZ和InhA，其分布位置主要集中在芽孢的外層與crust層。早在2009年，KIM等[19]利用枯草芽孢桿菌的衣殼蛋白CotE作為分子載體展示E.coliβ-半乳糖苷酶，結果顯示其酶活遠低于CotG作為分子載體得到的。HWANG等[20]以CotE和CotG為錨定蛋白展示E.coliβ-半乳糖苷酶時，發現當使用CotE時芽孢壁的完整性會受到影響，然而當錨定蛋白是CotG時芽孢壁則完全不受影響，表明CotG是展示E.coliβ-半乳糖苷酶的較佳錨定蛋白。有國內學者[21-23]將嗜熱脂肪芽孢桿菌(BacillusstearothermophilusIAM11001)β-半乳糖苷酶分別與CotB、CotC、CotG、CotX、CotY、CotZ融合，在B.subtilis168芽孢上成功展示β-半乳糖苷酶，測得酶活依次為0.30、0.14、0.46、0.42、0.12和0.25 U/mg芽孢(干重)。通過上述分析可知，重組芽孢表面展示的β-半乳糖苷酶活力與錨定蛋白的分布位置、分子尺寸大小有直接關系，表明錨定蛋白成為影響β-半乳糖苷酶展示效率的關鍵因素。

根據推測的芽孢表面展示過程及芽孢結構，目標蛋白與錨定蛋白形成的融合蛋白由于在芽孢表層的位置分布特點，其表達效率會在一定程度上受到某些豐富的、不完全協同的芽孢衣殼蛋白的影響。例如，TAVASSOLI等[24]利用CotC將B.subtilis168 β-半乳糖苷酶分別展示在野生型和CotC缺失型芽孢表面，結果發現前者重復使用3次后殘留酶活僅保留了50%，而后者仍達初始酶活的80%，說明CotC的缺失有助于進一步增強β-半乳糖苷酶的熱穩定性。表達載體的類型也是影響展示效率的因素之一。WANG等[23]以CotX為錨定蛋白研究了整合型和游離型表達方式對B.stearothermophilusIAM11001 β-半乳糖苷酶在芽孢表面展示效果的影響，兩種表達方式得到的活力分別為0.42和1.34 U/mg芽孢(干重)，表明游離型表達方式更有利于β-半乳糖苷酶在芽孢表面進行展示。

相較于重組型芽孢表面展示體系，非重組型芽孢表面展示體系和無錨定蛋白型芽孢表面展示體系的提出與構建為目標蛋白的表達提供了新思路。非重組型芽孢表面展示體系主要利用在酸性介質中外源蛋白與芽孢表面之間的吸附作用，這種展示策略類似于以芽孢為基質的固定化。SIREC等[18]利用芽孢吸附作用原理把酸熱脂環酸桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)β-半乳糖苷酶展示在芽孢表面，通過對crust層蛋白缺失的突變型與野生型芽孢進行深入分析，發現缺失任一crust層蛋白、外層結構完全缺失的芽孢比野生型芽孢具有更高的吸附效率。與非重組型芽孢表面展示體系相比，無錨定蛋白型芽孢表面展示體系是基于σE和σK控制的時期特異性型啟動子Pcry1Aa調控外源蛋白在芽孢形成后期的芽孢母細胞中表達進而分泌在芽孢表層策略，芽孢結構的疏水性、高電荷或靜電的芽孢表層對外源蛋白的吸附也起到促進作用[25]。通過這種方式構建的展示體系既省去了酶制劑的提純步驟，也克服了目標蛋白易于脫離芽孢的問題。2014年，PAN等[25]首次報道了在不使用錨定蛋白情況下利用Pcry1Aa啟動子將E.coliβ-半乳糖苷酶展示在芽孢表面，流式細胞儀、免疫電鏡和蛋白酶耐受性分析實驗確證了該酶的成功表達。然而目前僅有上述一篇報道文獻，說明其潛力仍有待進一步探究。

枯草芽孢桿菌被認為是芽孢表面展示體系的優選宿主，但也有學者[26]發現蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)外層蛋白InhA亦可將E.coliβ-半乳糖苷酶成功表達在芽孢表面，測得的酶活為0.4 U/mg芽孢(干重)。該研究豐富了β-半乳糖苷酶芽孢表面展示系統，也為其他外源蛋白提供了一條新的展示途徑。

2 β-半乳糖苷酶微生物細胞表面展示系統的應用

β-半乳糖苷酶微生物細胞表面展示系統的應用，主要集中在酶的制造、作為報告蛋白和全細胞催化劑。

2.1 生產β-半乳糖苷酶

將β-半乳糖苷酶錨定在微生物細胞或芽孢表面類似于對β-半乳糖苷酶進行固定化，但這種表面展示策略省去了冗繁的酶提純步驟及傳統的固定化操作，并且表現出更好的穩定性，使得工業化生產β-半乳糖苷酶在不久將來變成可能。近年來，國內外學者對β-半乳糖苷酶的微生物細胞表面展示體系進行了很多有益探究。例如，SIREC等[18]基于芽孢表層結構特點和目的酶蛋白特性將A.acidocaldariusβ-半乳糖苷酶吸附固定在野生型和突變型芽孢上，得到的展示酶在酸性介質中的熱穩定性顯著增強。TAVASSOLi等[24]發現由CotC直接融合得到的、表面展示有枯草芽孢桿菌β-半乳糖苷酶的重組芽孢經-20 ℃冷凍或37 ℃干燥復蘇后，僅有小部分酶活損失，重復使用3次后仍可保持80%的活性。

2.2 作為報告蛋白

β-半乳糖苷酶作為一種相對分子質量大的四聚體蛋白，常作為模式蛋白質廣泛用于生化檢測、科研分析等領域?；讦?半乳糖苷酶而開發的各類微生物細胞表面展示系統已在評估錨定蛋白錨定能力[6-7,9,22]，分析細胞壁、芽孢壁結構組成[19-20]等方面取得了良好的應用效果。

2.3 全細胞催化劑

據報道，來自韓國的PAN課題組是最早開展β-半乳糖苷酶微生物細胞表面展示的研究團隊，他們做了很多原創性的工作，其中影響力較大則是有關表面展示β-半乳糖苷酶的重組芽孢在兩相體系中轉糖基化反應方面的研究[3]。該文報道了E.coliβ-半乳糖苷酶經CotG錨定展示后，得到的重組芽孢酶活力達5×103U/g(干重)，熱穩定性和抗有機溶劑(如正己烷、乙醚、甲苯)的能力也顯著增加，而且重組芽孢在磷酸緩沖液-乙醚雙相反應體系中可催化100 mmol/L乳糖和100 mmol/L正辛醇產生27.7 mmol/L辛烷基-β-D-吡喃半乳糖苷。該研究同時指出目標產物產量增加的原因與重組芽孢主要分散在水相-有機相的界面有直接關系。在此基礎上，該課題組通過向上述兩相體系中加入1, 2-二甲氧基乙烷作為助溶劑的策略，在相同濃度底物條件下，使得辛烷基-β-D-吡喃半乳糖苷的產量提高到33.7 mmol/L[27]。新近研究[28]顯示，基于“Cohesin-Dockerin”特異性相互作用原理構建的β-半乳糖苷酶枯草芽孢桿菌芽孢表面展示體系，通過優化纖維小體中黏附模塊-對接模塊的組成和空間結構，使得表面展示的酶蛋白高達1.4×103/芽孢，酶的熱穩定性、重復利用性和貯藏穩定性也進一步提高，其在兩相體系中合成烷基糖苷的轉化率達35%(質量分數)。β-半乳糖苷酶在芽孢表面展示后不僅使其可重復利用性提升，其對有機溶劑的耐受性也大大增強。這些優良的特質使得β-半乳糖苷酶的芽孢表面展示系統在兩相體系催化領域有著廣闊的發展空間。

生物酶法合成功能性低聚糖一直是研究的熱點。WANG等[23]以CotX介導的β-半乳糖苷酶芽孢表面展示體系作為全細胞生物催化劑，能催化200 g/L乳糖和100 g/L果糖合成8.8 g/L乳果糖，可重復利用測試結果顯示該重組芽孢在連續轉化8次后仍保持初始活性的30.3%。LI等[13]利用釀酒酵母展示的P.expansumβ-半乳糖苷酶催化乳糖(100 g/L)合成GOS，其轉化率達43.64%(質量分數)，重復使用9次后，GOS產量和殘留的β-半乳糖苷酶活力均保持在較高水平。同時，該催化體系產生的反應產物葡萄糖和半乳糖還可分別用作酵母的碳源和表達β-半乳糖苷酶基因的誘導劑，因此實現了真正意義上的生物循環。在赤蘚糖醇發酵工業中，每年都有數千噸的廢酵母膏因無法處理而帶來環境問題。AN等[14]以表面展示有米曲霉β-半乳糖苷酶的Y.lipolyticaCGMCC 11369為全細胞催化劑，在500 g/L乳糖、5 mg/mL細胞(干重)、pH 5.5、60 ℃條件下，GOS產量達160 g/L，轉化率為51%(質量分數)，且循環利用10次后重組酵母細胞仍能保留初始酶活的80%。這些研究結果表明β-半乳糖苷酶的微生物表面展示體系作為全細胞催化劑在資源循環利用方面有著巨大的潛力。

3 結語

相比于游離酶與固定化酶，β-半乳糖苷酶的微生物表面展示技術克服了諸如穩定性差、有機溶劑不耐受、難以回收、純化過程復雜等問題。綜合上述3大微生物表面展示系統各自的優缺點，不難發現，雖然乳酸菌表面展示系統能利用表層蛋白和一些細胞壁結合結構域展示β-半乳糖苷酶，但是原核表達的缺陷以及較厚的細胞壁始終限制著β-半乳糖苷酶的體內表達。酵母細胞由于是真核宿主，擁有促進蛋白折疊和正常分泌的生物合成裝置，較之乳酸菌，酵母細胞表面展示β-半乳糖苷酶有著很大的優勢。但是較差的遺傳穩定性和較少的可供選擇的錨定蛋白等因素嚴重制約著該展示系統的進一步開發與應用。與前兩者展示系統不同的是，憑借著芽孢自身獨特的抗逆性與特殊的無細胞膜結構，β-半乳糖苷酶的芽孢表面展示系統克服了諸如β-半乳糖苷酶表達折疊不正確、與宿主結合不夠牢固等缺點，使得其在工業用酶的生產、作為報告蛋白和全細胞催化劑領域有著十分樂觀的應用前景。不過目前成功實現芽孢表面展示的β-半乳糖苷酶酶活較低，影響展示效率的機制也不明確，深入研究芽孢的結構與衣殼蛋白的組裝機理，開發新的錨定蛋白和展示策略將有利于提高β-半乳糖苷酶展示效率。構建人工芽孢顆粒也為表面展示技術在β-半乳糖苷酶領域的廣泛應用提供了新思路。可以預見，β-半乳糖苷酶的微生物表面展示系統尤其是芽孢表面展示系統將會成為未來β-半乳糖苷酶產業應用和發展的主流。