CRISPRi干擾中心代謝基因轉錄對蘇氨酸合成的影響

劉旭峰，王寧，郝亞男，李英滋，范曉光,2，謝希賢,2*

1(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室(天津科技大學)，天津，300457) 2(天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津，300457)

蘇氨酸化學名為α-氨基-β-羥基丁酸，是人體必需的8種氨基酸之一[1]。主要應用于醫藥衛生、食品強化劑、飼料添加劑等方面。蘇氨酸是繼谷氨酸和賴氨酸，世界第三大氨基酸產品[2]。大腸桿菌由于繁殖迅速、發酵溫度高、生理生化基礎研究比較深入等特征，成為蘇氨酸生產最主要的菌株。蘇氨酸工程菌的構建經歷了2個重要的階段。(1)誘變育種階段，日本味之素株式會社椎尾勇等，經誘變育種篩選出有產蘇氨酸能力的菌株；(2)基因工程階段，研究人員運用代謝工程技術與系統生物學方法構建蘇氨酸工程菌，如韓國LEE等[3]。

蘇氨酸作為大宗氨基酸產品，提高發酵產率和糖酸轉化率可顯著降低生產成本，提高經濟效益。常規基因工程技術和代謝工程技術一般采用加強主要代謝途徑，阻斷競爭代謝途徑以減少代謝分流來提高產品合成效率，但是一些競爭途徑的代謝基因敲除經常會對細胞生長造成負面影響[4-5]。代謝干擾可以根據需要調節基因轉錄和蛋白表達水平，進而優化代謝網絡，提高合成效率[6]。目前，代謝干擾主要方法有反義RNA技術和CRISPRi技術[7-8]。反義RNA技術因具有操作簡單，適用范圍廣泛，特異性強以及安全性高的特點被應用于代謝干擾研究。反義RNA技術中sRNAs(small regulatory RNAs)調控基因轉錄技術應用較為廣泛。sRNAs由2個部分組成：支架序列和目標綁定序列，在大腸桿菌中自然形成二級結構，該二級結構能夠識別目標mRNA并為Hfq蛋白提供1個支架，使目標mRNA降解或三者結合形成的復合物阻礙核糖體與目標mRNA的結合，從而調節相關基因的轉錄水平。NA等[9]以1，5-戊二胺工程菌E.coliXQ56為出發菌，利用sRNAs技術調控基因murE表達，在高密度培養的條件下，對應菌株產酸較原菌XQ56高31%。CRISPRi技術是基于RNA引導的DNA核酸內切酶的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統發展而來，與CRISPR/Cas9系統不同之處在于前者的Cas9蛋白失去了DNA核酸內切酶的活力[10]。CRISPRi干擾體系由dCas9蛋白和sgRNA兩個組件構成，其中與dCas9蛋白共同表達的sgRNA由3部分組成：20 nt目標基因特定核苷酸區域的識別序列、42 nt dCas9蛋白結合序列以及40 nt轉錄終止子序列[11-13]。CRISPRi工作機制為當成熟的sgRNA引導dCas9蛋白結合在DNA的特定位置時，三者形成的復合物能夠影響轉錄延伸、RNA聚合酶以及轉錄因子的結合，從而實現調節基因表達水平的目的。CRISPRi技術具有靈活高效的特點，可以調控任意基因轉錄水平，該技術現在也已經被廣泛應用于代謝工程領域和合成生物領域[14-21]。

本研究以蘇氨酸工程菌E.coliTHRD為出發菌，依據CRISPRi干擾機制[18, 20]，建立了基于阿拉伯糖誘導的CRISPRi代謝干擾系統，該系統首先將dcas9基因整合在基因組上并受控于阿拉伯糖啟動子，同時，用pGRB質粒表達特異的sgRNA。利用上述干擾體系研究中心代謝途徑主要基因的轉錄水平的改變對蘇氨酸合成的影響。發酵結果表明，調節zwf、pfkA以及gltA基因的表達水平可以提高工程菌的蘇氨酸合成效率。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

蘇氨酸工程菌E.coliTHRD保藏在天津科技大學菌種保藏中心，實驗所涉及的菌種及質粒見表1。

表1 本實驗所用菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids in this study

1.2 培養條件與培養基

大腸桿菌THRD工程菌及完成基因編輯的菌株培養條件為LB培養基、37 ℃培養，含有pRedCas9質粒的菌株培養條件為LB培養基、32 ℃培養；大腸桿菌DH5α用于構建和克隆質粒，培養條件為LB培養基、37 ℃培養。氨芐青霉素工作質量濃度為100 μg/L；奇霉素工作質量濃度為100 μg/L。

LB培養基，2-YT培養基和SOC培養基參見分子克隆實驗指南。

蘇氨酸種子培養基配方：25 g/L蔗糖、10 g/L酵母粉、6 g/L蛋白胨、1.2 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4、 10 mg/L MnSO4、10 mg/L FeSO4、1.3 mg/L VB1、0.3 mg/L VH。

蘇氨酸發酵培養基：30 g/L葡萄糖、2 g/L酵母粉、4 g/L蛋白胨、1 g/L檸檬酸鈉、2 g/L KH2PO4、0.7 g/L MgSO4、0.1 g/L MnSO4、0.1 g/L FeSO4、0.8 mg/L VB1、0.2 mg/L VH。

1.3 CRISPR/Cas9基因編輯方法

利用CRISPR/Cas9技術對菌株進行基因編輯[22-24]。CRISPR/Cas9系統包括pGRB和pRedCas9兩個質粒，其中pRedCas9質粒包含pGRB的消除系統、重組酶、Cas9蛋白表達系統和奇霉素抗性；pGRB質粒包括gRNA序列、Cas9蛋白結合區域序列、終止子序列和氨芐青霉素抗性。構建質粒pGRB的目的是為了轉錄相應sgRNA，與Cas9蛋白形成復合體并識別靶位點，使Cas9蛋白準確切割雙鏈目的基因。同時，在重組酶的作用下，通過同源重組將目的DNA片段整合在基因組上，完成基因編輯。

1.3.1 構建gRNA質粒和DNA片段的獲得

為了構建gRNA質粒，先設計合成2條反向互補的單鏈DNA，通過退火形成雙鏈DNA，該雙鏈DNA中間序列為靶位點的特定gRNA間隔序列，兩端序列與pGRB具有同源序列。雙鏈DNA與線性化pGRB通過同源重組形成gRNA表達質粒。

利用引物設計軟件primer 5，以待編輯基因的上下游序列為模板，設計上下游同源臂引物；以待整合基因為模板，設計整合基因的擴增引物。通過PCR的方法分別擴增上下游同源臂和目的基因片段，再經過重疊PCR制備重組片段。

1.3.2 菌株構建

首先，將pRedCas9質粒通過電轉導入E.coliTHRD感受態細胞中。通過菌落PCR篩選正確的陽性轉化子，并將該菌株接種于LB培養基32 ℃過夜培養，然后按1%的接種量轉移到100 mL 2-YT培養基中，32 ℃ 培養細胞OD600達到0.1～0.2，添加0.1 mmol/L IPTG誘導重組酶表達，繼續培養細胞OD600達到0.4～ 0.5，收集菌體制備電轉感受態細胞。將200 ng重疊DNA片段和100 ng gRNA質?；靹蛟陔娹D感受態細胞中，并轉移至0.1 cm電轉杯中，用Eppendorf電轉儀在1 850 kV條件下將質粒和DNA片段導入細胞，同時加入1 mL SOC中32 ℃復蘇2 h，然后取100 μL 涂布到含氨芐和奇霉素抗性的LB平板上，32 ℃ 過夜培養。隨機挑取單菌落進行菌落PCR驗證，根據菌落PCR的DNA片段大小確定陽性重組菌株。將陽性菌株在含有0.3 g/L阿拉伯糖的LB培養基中培養，誘導pRedCas9中pGRB消除系統將pGRB消除；由于pRedCas9是溫敏型質粒，通過將菌株在42 ℃下培養消除pRedCas9質粒，獲得無質粒工程菌株。

1.4 干擾質粒及菌株構建

干擾質粒與gRNA質粒構建方法相同，方法同上。將構建成功的干擾質粒電轉至以THRD-1為基礎的蘇氨酸大腸桿菌工程菌中，取100 μL稀釋涂布到含氨芐抗性的LB平板上，37 ℃過夜培養，篩選陽性菌株。

1.5 蘇氨酸發酵

將菌株經斜面活化后接種于裝液量為30 mL的種子培養基中(500 mL搖瓶)，37 ℃，200 r/min條件下培養10 h。然后以10%接種量轉接到發酵培養基中，并在發酵培養4 h添加誘導劑阿拉伯糖，終質量濃度控制在0.6 g/L。在37 ℃，200 r/min條件下發酵培養24 h。

1.6 發酵過程中檢測與分析

大腸桿菌生物量的測定利用分光光度計在600 nm處的吸光度(OD600)檢測。

發酵液中殘余的葡萄糖及合成的有機酸采用高效液相分析儀(HPLC)檢測。檢測方法：取1 mL發酵液，13 000 r/min離心2 min留取上清。將上清液過膜處理后，開始進行色譜分離。色譜分離條件：色譜柱為AminexRRHPX-87H(300 mm×7.8 mm)，流動相為5 mmol/L H2SO4，柱溫為30 ℃，檢測波長為215 nm，流動相總流速為0.5 mL/min，采用等濃度洗脫的方法。

蘇氨酸采用高效液相分析儀(HPLC)柱前衍生測定。衍生方法：取1 mL發酵液，13 000 r/min離心2 min留取上清。在1.5 mL離心管中加入200 μL衍生緩沖液(42%(質量分數)NaHCO3溶液)，加入10 μL 發酵液混勻后，再加入衍生試劑溶液(1%(質量分數)2，4-二硝基氟苯乙腈溶液)300 μL搖勻，將離心管置于65 ℃水浴鍋中反應1 h后取出。將樣品冷卻至室溫后，加入定容緩沖液(68%(質量分數)KH2PO4溶液)690 μL搖勻，然后將樣品過膜處理，開始進行色譜分離。色譜分離條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm × 150 mm，5 mm)，流動相為乙腈-乙酸鈉緩沖液，柱溫為33 ℃，檢測波長為360 nm，流動相總流速為1 mL/min， 采用二元梯度洗脫的方法。

1.7 總RNA的提取和實時熒光定量PCR

根據aceE、dcas9和E.coliW3110 16S rDNA(rrnb，內參)基因序列采用Premier 5.0 軟件設計用于RT-PCR的引物。發酵培養10 h取樣，并參照Promega試劑盒說明書要求提取RNA，參照RR036A試劑盒進行反轉錄，RT-PCR體系及方法參照SYBRR Premix EX-Taq TM Ⅱ試劑盒說明書。首先擴增目的基因和內參基因，通過分析擴增曲線指數增長期的平行性來確定擴增倍數作為后續實驗的標準，然后對菌株的目的基因和內參基因進行定量測定(每個樣本3個重復)，并用ΔΔCt法分別計算基因aceE和dcas9相對轉錄量。ΔΔCt法計算流程：步驟一，內參基因均一化樣品差異，即Ct(目的基因)-Ct(內參基因)= ΔCt；步驟二，實驗樣品和對照樣品比較，即ΔCt(實驗樣品)- ΔCt(對照樣品)= ΔΔCt；步驟三，使用公式計算，即倍數變化=2-ΔΔCt，式中Ct(循環閾值)即PCR擴增過程中擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閥值時所經過的擴增循環數。

1.8 發酵數據統計學分析

發酵數據代表3組平行發酵數據的平均值和標準偏差。利用T檢驗雙尾分布對2組發酵參數進行單向方差分析。0.01

2 結果與分析

2.1 阿拉伯糖誘導代謝干擾系統的構建

目前，有關CRISPRi干擾技術的研究均采用dcas9基因和sgRNA共表達體系，該體系通過單質粒表達實現調節基因轉錄水平的目的。但由于dcas9基因過大，采用單質粒過表達的方式，會增加菌體生長負擔。為了減輕干擾系統引入對細胞生長的影響，本實驗首先構建了一套基于阿拉伯糖誘導的干擾體系。利用CRISPR/Cas9基因編輯方法，以蘇氨酸工程菌E.coliTHRD為出發菌，將dcas9基因整合在基因組的araB、araA、araD基因位置位點，受控于阿拉伯糖啟動子Para。在代謝工程研究中，通過誘導調控基因表達是常用的改造策略，常用的誘導劑有乳糖、木糖、四環素和阿拉伯糖等。比較而言，阿拉伯糖誘導具有嚴緊性以及對菌體沒有毒害作用的特點[25]。隨后為了減少葡萄糖對阿拉伯糖啟動子的阻遏，根據文獻報道[26]，對mlc基因啟動子-10區進行點突變，解除葡萄糖效應，構建了菌株THRD-1。最后，將干擾特定基因的sgRNA連接到質粒pGRB上，通過電轉導入THRD-1菌株中，構建相應的干擾菌株。

2.2 阿拉伯糖誘導條件下的代謝干擾體系測試

為了測試代謝干擾體系的可行性和阿拉伯糖誘導的嚴緊性，本實驗構建了干擾aceE基因的pGRB質粒，并導入菌株THRD-1，檢測阿拉伯糖誘導條件下的aceE基因和dcas9基因轉錄水平變化。前期研究報道[27]，sgRNA設計與非模板鏈DNA鏈結合有較高的靶向效率，與模板鏈結合的sgRNA僅表現出較弱的靶向效率，且sgRNA靶向基因的ATG區域效果優于啟動子區域，sgRNA靶向啟動子區域與編碼區中部效率相當。為了研究不同區域的sgRNA對基因轉錄的抑制作用，針對aceE基因構建了3個不同的靶向sgRNA序列，分別為aceE基因非模板鏈的ATG區域、編碼區中部區域和編碼區尾部區域(圖1-A)。

通過RT-PCR對阿拉伯糖誘導條件下的基因dcas9進行轉錄分析，未誘導條件下dcas9基因的轉錄量定為1，經阿拉伯糖誘導后的dcas9表達量是未誘導條件下的233倍(圖1-B)，說明阿拉伯糖可以有效地誘導dcas9的表達。隨后對阿拉伯糖誘導條件下的基因aceE進行轉錄分析，結果如圖1-C所示。

A-sgRNA靶向基因aceE不同位置示意圖；B-不同培養條件下，基因dcas9相對轉錄；C-不同的培養條件和干擾位置，基因aceE相對轉錄量NI-未添加阿拉伯糖；I-添加阿拉伯糖圖1 阿拉伯糖誘導干擾體系測試Fig.1 Test of arabinose-induced interference system

對照菌株THRD-1(pGRB)中基因aceE的轉錄量定為1，菌株THRD-1(pGRB-aceE1) 在未誘導條件下基因aceE轉錄量沒有降低，說明了阿拉伯糖誘導系統的嚴緊性。在阿拉伯糖誘導條件下，干擾ATG區域的菌株THRD-1(pGRB-aceE1)和干擾編碼區中部區域的菌株THRD-1(pGRB-aceE2)中，基因aceE的轉錄量分別降低了77.78%和74.56%，干擾編碼區尾部區對基因aceE轉錄沒有效果。由此可以看出，抑制基因aceE轉錄強弱的順序依次為：ATG區域、編碼區中部區域和編碼區尾部區域，與文獻報道一致[28]。

2.3 干擾中心代謝基因對蘇氨酸生產的影響

由圖1的結果可以看出，利用基于阿拉伯糖誘導的CRISPRi干擾體系可以有效地調節目的基因的轉錄水平。為了提高蘇氨酸的合成效率，本實驗選擇了中心代謝的關鍵基因zwf、pfkA、pykF、pck、aceE、gltA、sucA、sucC和sucD為干擾對象，分析9個基因的轉錄水平變化對蘇氨酸合成的影響。每個靶向基因選擇2個不同的干擾區域以實現不同的抑制水平，干擾的位置分別為對應基因的ATG區域和編碼區中部區域。構建相應的干擾質粒并導入THRD-1，搖瓶發酵24 h，測定菌體生物量、葡萄糖消耗和蘇氨酸產率，結果如表2所示。

表2 干擾中心代謝不同基因的菌株蘇氨酸發酵結果Table 2 Results of threonine fermentation with strains by interfering different central metabolic genes

注：*表示0.01

發酵結果顯示，干擾pykF、pck、aceE、sucA、sucC和sucD基因的轉錄對菌株產酸和糖酸轉化率方面沒有明顯的提升，說明干擾上述基因并不能提高蘇氨酸生產菌的產酸效率。干擾zwf、pfkA和gltA基因對蘇氨酸的產率和糖酸轉化率都有不同程度的提高，這也證明可以采用CRISPRi技術來篩選對蘇氨酸合成具有正向效果的基因。

zwf基因是葡萄糖6-磷酸進入HMP途徑的關鍵基因，而HMP途徑是蘇氨酸合成的支路途徑和生成CO2的主要途徑。調節zwf基因的表達水平可以減緩HMP途徑的代謝速率，減少碳源流失，使更多的碳源流向蘇氨酸。干擾zwf基因的ATG區域和編碼區中部區域，對應菌株蘇氨酸產量分別為60.3和60.1 g/L，與對照菌株(50.9 g/L)相比，分別提高了18.5%和18.1%。發酵培養24 h，兩者消耗葡萄糖的量均為150 g/L，糖酸轉化率均為40%。

pfkA基因是EMP途徑的關鍵基因，該基因編碼的6-磷酸葡萄糖激酶是EMP途徑的限速酶，調節pfkA基因的轉錄水平，使EMP途徑代謝速率變緩，減緩中心代謝速率，優化代謝網絡，提高蘇氨酸合成效率。干擾pfkA基因的ATG區域和編碼區中部區域，對應菌株蘇氨酸產量分別為64.6和63.6 g/L，與對照菌株(50.9 g/L)相比，分別提高了26.9%和25.0%。發酵培養24 h，消耗葡萄糖的質量濃度為170 g/L，糖酸轉化率分別為38%和37%，與對照菌株34%相比分別提高了11.8%和8.8%。

gltA基因是乙酰輔酶A進入TCA循環的關鍵基因，調節gltA基因的轉錄水平，減緩TCA循環的代謝速率，進入TCA循環的草酰乙酸相對減少，更多的草酰乙酸進入蘇氨酸合成途徑，使蘇氨酸的產率和糖酸轉化率有一定程度的提高。干擾gltA基因的ATG區域和編碼區中部區域，對應菌株的蘇氨酸產量分別為65.8和63.6 g/L，與對照菌株(50.9 g/L)相比，分別提高了29.3%和25.0%。發酵培養24 h，消耗葡萄糖質量濃度為170 g/L，糖酸轉化率分別為39%和37%，與對照菌株(34%)相比，分別提高了14.7%和8.8%。

依據上述結果分析，調節zwf、pfkA和gltA基因的表達水平，對應菌株的蘇氨酸產率和糖酸轉化率都有一定程度的提高。對同一基因而言，干擾基因ATG區域對應的菌株在蘇氨酸產率和糖酸轉化率方面均優于干擾基因編碼區中部區域的菌株。對不同基因而言，調節pfkA和gltA基因的轉錄水平，均提高了蘇氨酸的產率和糖酸轉化率，且兩者提升的幅度相同。雖然兩者減緩了中心代謝速率，重新平衡了代謝網絡，但重新平衡代謝網絡后的菌株對葡萄糖的需求量有所增加，導致兩者在糖酸轉化率方面的提升幅度不及產酸方面。相比pfkA和gltA基因，調節zwf基因的轉錄水平，雖然在蘇氨酸產率方面不及前兩者，但由于在發酵培養過程中消耗葡萄糖的量相對較少，所以在蘇氨酸糖酸轉化率方面優于前者。同時，表2中菌株的OD600與對照菌株差別不大，表明調節基因的表達水平對菌體的生長沒有顯著影響。

3 結論

隨著基因工程技術的不斷發展，調節合成代謝途徑基因的表達水平，優化合成代謝網絡變得越來越重要。傳統代謝工程研究中，為了增加目標產品的積累，通常通過刪除相關基因，阻斷支路途徑來減少中間產物的消耗。然而，如果缺失的基因是必需的，細胞就會死亡或嚴重影響細胞生長。CRISPRi技術在轉錄層面調節目標基因的表達，避免了傳統基因敲除方法的缺點，可以在不影響細胞生長的情況下調整和優化產物的合成代謝網絡。

為了提高蘇氨酸合成效率，本研究在蘇氨酸工程菌建立了基于阿拉伯糖誘導CRISPRi干擾體系，并系統分析了中心代謝中關鍵基因表達水平的調節對蘇氨酸合成的影響。結果表明，在阿拉伯糖的誘導條件下，通過調節zwf、pfkA和gltA基因轉錄水平，可以顯著提高蘇氨酸的產率和糖酸轉化率。本研究為構建更高效的蘇氨酸工程菌奠定了理論基礎，也為其他生物制品的工程菌構建提供了實踐參考。進一步的研究中，可以通過CRISPRi同時干擾多個靶基因，對蘇氨酸合成代謝網絡進行更好的調控，進一步提高蘇氨酸產率和糖酸轉化率。另外，還可以將對蘇氨酸合成有益的相應sgRNA模塊整合在基因組上，構建無質粒的工程菌。