核桃粕多肽酸乳飲料穩定劑配方優化及性能表征

楊媛媛，潘建龍，宴正明，張潤光，張有林*

1(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710000)2(安康市瀛天生態農林開發有限公司，陜西 安康，725000) 3(陜西省林業科學研究院，陜西 西安，710000)

核桃(JuglansregiaL.)是胡桃科核桃屬植物，為世界四大干果之一。核桃仁中蛋白質含量高達15%～25%，具有健胃、補血、潤肺、養神等功效，被稱為是天然營養補品[1-2]。核桃仁冷榨取油后的副產物核桃粕中蛋白質含量高達54%[3]，但目前未得到充分利用，造成資源浪費。乳酸菌發酵食品具有降低血糖，調節腸胃，增強免疫等功能[4]。利用乳酸菌發酵植物蛋白開發集蛋白質營養價值與乳酸菌保健功能于一體的新型發酵飲料，可成為開發利用核桃的一種新途徑。

關于酸性植物蛋白飲料的研究有諸多報道，王才華等[5]對大豆蛋白乳酸菌飲料的制備工藝進行了研究；李博等[6]選育出一株蛋白酶活性高，發酵活力好的乳桿菌株用于制備花生酸乳。酸性蛋白飲料中蛋白質易沉淀，目前主要通過添加穩定劑解決這一問題。不同穩定劑對酸乳體系的性質、產品的口感影響很大，實際生產中添加單一穩定劑效果很不理想，往往需要復配使用[7]。NTAZINDA等[8]研究，將羧甲基纖維素鈉和可溶性大豆多糖復配，有效降低了沉淀率和平均粒徑，改善了產品的口感。KIANI等[9]將結冷膠與果膠復配，極大延長了酸性乳飲料的貨架期。LIU等[10]將可溶性大豆多糖和果膠復配，結果表明果膠的加入限制了可溶性大豆多糖吸附到酪蛋白上，不利于酸乳的穩定。因此復配穩定劑效果不一，需進一步驗證。本試驗在前人研究的基礎上篩選出生產核桃粕多肽酸乳飲料理想的單一穩定劑羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)、高酯果膠(high methoxyl pectin，HMP)和阿拉伯膠(gum arabic，GA)，進行單因素和正交試驗，并通過測定產品流變學特性、觀察微觀結構變化和感官鑒評，確定最佳復配方案，旨在為復合穩定劑的研究提供理論基礎，為核桃粕多肽酸乳飲料的開發提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

核桃為香菱品種由西安市核桃良種繁育基地提供；風味蛋白酶為北京索萊寶科技有限公司產品；乳酸菌發酵劑為昆山佰生優生物科技有限公司產品；CMC-Na為國藥集團化學試劑有限公司產品；HMP為丹尼斯克(上海)公司產品；GA為鄭州裕和食品添加劑有限公司產品；白砂糖、牛奶為市售。以上材料均為食品級。

1.1.2 儀器與設備

JM-50型膠體磨，西安永興食品藥化機械公司；LRH-250生化培養箱由上海一恒科技有限公司；MK3型全波長酶標儀，美國熱電公司；AR-G2型流變儀，美國TA公司；黏度計，美國Brookfield有限公司；FV1200激光共聚焦顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；BI-90Plus激光粒度儀，美國布魯克海文儀器公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃粕多肽酸乳飲料制備工藝

1.2.2 操作要點

(1)乳酸菌的活化及馴化

參考楊勝敖等[11]的方法。菌種活化：取脫脂乳5 mL，裝于試管，塞口，121 ℃殺菌20 min。冷卻后，加入1 g/L的發酵劑菌粉，置于37 ℃的恒溫條件下培養12 h。菌種的馴化：采用梯度濃度馴化法，將活化的乳酸菌菌種(接種量為4%)依次接入含核桃酶解液與脫脂乳質量比為5∶5、 6∶4、7∶3、8∶2、 9∶1、10∶0 的混合物中，37 ℃培養至凝乳。經多次馴化，直至混合菌種生長良好，凝乳快，才可作為生產發酵劑。-18 ℃凍藏備用。

(2)核桃粕酶解液的制備

酶解:稱取定量核桃粕與沸水按比例1∶12(g∶mL)混合，充分攪拌，待冷卻后加入檸檬酸調節pH至6.0，加入風味蛋白酶，在50 ℃下保溫水解。

滅酶：酶解液沸水浴20 min。

(3)核桃酶解液的發酵

在上述制備好的酶解液中加入牛奶、白砂糖、穩定劑等，均質， 70 ℃殺菌30 min，冷卻后接種一定量的乳酸菌發酵。在4 ℃下冷藏后熟，取樣分析。

1.2.3 核桃粕多肽酸乳飲料穩定性研究

單因素試驗：對前期篩選出的CMC-Na、HMP和GA三種穩定劑，考察添加量對樣品穩定性、感官評分、黏度和粒徑的影響，綜合評價各穩定劑的效果。

正交試驗：在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗對3種穩定劑進行復配，確定出最佳配方。

1.2.4 穩定系數的測定

參考周文化等[12]的方法：離心機將樣品在3 000 r/min離心10 min，分別取離心后的上清液和核桃粕多肽酸乳飲料，稀釋100倍，在501 nm波長下測定吸光值，穩定系數按公式(1)計算。

(1)

1.2.5 綜合評分方法

參考馬永軒等[13]的方法，對核桃粕多肽酸乳飲料樣品隨機編號，并分裝到專用品評杯中，食品專業的品評員10名，對樣品按表1進行感官評分，按公式(2)計算每個樣品的綜合評分值。

綜合評分=穩定系數×30%+感官評分×70%

(2)

表1 感官評分表Table 1 Sensory score sheet

1.2.6 黏度測定

將添加了不同濃度穩定劑的核桃粕多肽酸乳飲料樣品攪拌均勻，用黏度計測定，設置轉速200 r/min，測定溫度15 ℃，每個樣品3次重復。

1.2.7 粒徑測定

添加不同濃度穩定劑的樣品冷藏1d后，利用Brookhaven BI-90 Plus激光粒度分析儀測定其粒徑分布情況。

1.2.8 流變學研究

參考張雅媛等[14]和CUI等[15]的方法作以下改動：采用穩態模式，剪切速率0.1～100 s-1，溫度25 ℃，每10 倍頻率取10 個數據點，測定黏度及剪切力隨剪切速率的變化。對添加復配穩定劑的核桃粕多肽酸乳飲料樣品及未添加穩定劑的樣品每次取樣1.5 mL，進行流變學特性研究。

1.2.9 微觀結構測定

參考侯俊杰[16]的方法，將新制備的樣品和儲存7 d的樣品，每毫升加入40 μL尼羅藍染液對蛋白質染色30 min，在激發波長633 nm條件下放大40倍，用激光共聚焦顯微鏡觀察添加復配穩定劑的樣品及未添加穩定劑的樣品中蛋白質分布及微觀結構。

1.3 數據處理

采用Excel和Origin 8.5軟件分析和繪圖，并采用Duncan’s進行多重比較，試驗設置3次重復，差異顯著水平取0.05。

2 結果與分析

2.1 CMC-Na、HMP和GA對核桃粕多肽酸乳飲料品質的影響

不同穩定劑添加量對核桃粕多肽酸乳飲料綜合評分的影響見圖1。由圖1看出，添加單一穩定劑與不添加穩定劑相比，綜合評分均顯著增加(P<0.05)。由圖1-A看出樣品的綜合評分隨著CMC-Na添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，添加量為1.2 g/L時，樣品綜合評分為78.01。其原因是CMC-Na屬陰離子多糖，在酸性條件下吸附于蛋白質表面，該吸附層提供的空間位阻效應維持了體系穩定，隨著CMC-Na添加量的增加，穩定體系被破壞，口感變差[17]。

圖1 三種穩定劑不同添加量對核桃粕多肽酸乳飲料品質的影響Fig.1 Effect of different addition amount of three stabilizers on quality of walnut polypeptide yogurt drink

由圖1-B看出，樣品的綜合評分隨著HMP添加量的增加先上升后逐漸趨于平緩，添加量為0.9 g/L時，綜合評分為80.35，這與NAKAMURA等[18]研究結果一致，其原因是HMP與蛋白質復合膠粒間的靜電排斥作用維持著酸乳體系穩定，添加量太高，會增加酸乳的黏稠感。由圖1-C可以看出，隨著GA添加量的增加樣品綜合評分呈先上升后下降，添加量為70 g/L 時，樣品的綜合評分為80.03，因為是在酸性環境中GA能夠通過靜電作用與部分蛋白質結合，隨著GA添加量的增加，樣品中會出現絮凝現象，體系失穩。

2.2 CMC-Na、HMP和GA對核桃粕多肽酸乳飲料黏度的影響

3種穩定劑的添加量對核桃粕多肽酸乳飲料黏度的影響見圖2。

圖2 三種穩定劑不同添加量對核桃粕多肽酸乳飲料黏度的影響Fig.2 Effect of different adding quantity of stabilizers on the viscosity of walnut polypeptide yogurt drink

由圖2看出，樣品的黏度隨著CMC-Na、HMP、GA添加量的增加而增加。據TROMP等和KASTNER等[19-20]報道，其原因是在酸性環境中，CMC-Na、HMP和GA均可與酸乳中的部分蛋白質形成靜電復合物，由靜電作用以及分子間的摩擦力增大，導致樣品黏度增加。

2.3 CMC-Na、HMP和GA對核桃粕多肽酸乳飲料粒徑的影響

根據斯托克斯定律，顆粒的直徑越小，沉降速度越慢，體系越穩定[21]。3種穩定劑的添加量對核桃粕多肽酸乳飲料平均粒徑的影響見圖3。由圖3-A可以看出，隨著CMC-Na添加量的增加，樣品的平均粒徑呈先增大再減小最后增大的趨勢，添加量為1.2 g/L時，粒徑值最小為(1.26±0.01) μm，這是因為低添加量時，CMC-Na不能充分吸附于蛋白質上，造成蛋白質分子聚集，粒徑增大；當其添加量為1.2 g/L時，足以覆蓋于蛋白質表面，此時蛋白質穩定不聚集；當添加量高于0.12%時，CMC-Na在蛋白質上發生多層吸附，粒徑增大。由圖3-B可以看出，隨著HMP添加量的增加，樣品的平均粒徑顯著減小(P<0.05)，添加量為0.5 g/L時粒徑最小為(0.94±0.02) μm。這說明在一定的添加量范圍內，HMP和蛋白質能夠通過靜電作用形成復合物，阻止蛋白質分子聚集，減小粒徑，該結論與李向東等[22]關于HMP對含乳飲料粒徑的影響研究結果相一致。由圖3-C可以看出，隨著GA添加量的增加，樣品的平均粒徑呈先下降后上升再微下降的趨勢，添加量為50 g/L時，粒徑最小為(1.07±0.05) μm，這可能是GA分子為球形構象，蛋白質更易與其側鏈的羧酸基團相互作用從而降低GA分子內部的靜電斥力，使其收縮，但添加量繼續增加，復合物粒徑會增大。

圖3 三種穩定劑不同添加量對核桃粕多肽酸乳飲料粒徑的影響Fig.3 Effects of different addition amount of threa stabilizers on particle size of walnut polypeptide yogurt drink

2.4 穩定劑復配正交試驗

在上述單因素試驗的基礎上對CMC-Na、HMP、GA復配及添加量試驗，采用L9(34)正交表，進行正交試驗，以綜合評分為指標評價穩定劑復配效果，選出最優組合及用量，正交試驗結果見表3。

表2 穩定劑配方優化試驗因素水平表Table 2 Stabilizer formula optimization test factor level table

表3 穩定劑復配正交試驗結果及分析Table 3 Stabilizer compounding orthogonal test results and analysis

由表3極差分析可知，穩定劑對產品綜合評分影響的主次順序為：GA>HMP>CMC-Na，最佳組合為A1B1C3， 即CMC-Na添加量1 g/L、HMP添加量0.9 g/L、GA添加量70 g/L。在此條件下又進行驗證試驗，測得核桃粕多肽酸乳飲料的穩定系數為80.21，感官得分為82.20，綜合評分為81.60，與表3中最高綜合評分差異不顯著(P<0.05)，綜合考慮，最終復配選用A1B1C3。

2.5 核桃粕多肽酸乳飲料流變學特性

采用AR-G2型流變儀測定添加最佳復配穩定劑前后的核桃粕多肽酸乳飲料樣品的流變學特性，作出黏度-剪切速率，剪切應力-剪切速率的關系圖，見圖4。

A-黏度—剪切速率；B-剪切應力—剪切速率圖4 核桃粕多肽酸乳飲料的黏度—剪切速率和剪切應力—剪切速率曲線圖Fig.4 Viscosity-shear rate and shear stress-shear rate profile of walnut polypeptide yogurt drink

由圖4-A看出，添加復配穩定劑后，核桃粕多肽酸乳飲料黏度隨著剪切速率的升高而降低，最后趨于平緩，而復配前的樣品黏度隨著剪切速率的增加先減小后基本保持不變，直至和水的黏度相等。由圖4-B看出，復配后的核桃粕多肽酸乳飲料剪切應力隨著剪切速率的增大而增大，而未復配樣品剪切應力變化趨勢和水接近。根據牛頓剪切應力公式可以判斷，添加復配穩定劑后，核桃粕多肽酸乳飲料出現剪切稀化現象，反映出非牛頓流體特性，屬假塑性流體。未添加復配穩定劑的樣品，在高剪切速率下，呈現出牛頓流體的特性[23-24]。綜合圖4-A、圖4-B看出，加入穩定劑后核桃粕多肽酸乳飲料黏度顯著增加(P<0.05)。

2.6 核桃粕多肽酸乳飲料微觀結構

本試驗對添加復配穩定劑前后的核桃粕多肽酸乳飲料通過激光共聚焦顯微鏡觀察微觀結構，結果如圖5所示。

圖5 核桃粕多肽酸乳飲料激光共聚焦顯微鏡圖Fig.5 Laser confocal microscopy of walnut peptide polypeptide milk drink注：比例尺子-100 μ m。

圖5-A、圖5-B分別為儲藏0 d添加復配穩定劑前后的樣品圖像。由圖5可知，未添加穩定劑的樣品，蛋白凝聚，分布松散不均一，添加復配穩定劑的樣品蛋白質粒徑明顯減小，且分布更為密集。該結果與盛林霞[25]對酸性乳飲料中穩定劑復配機理的研究結論一致，其原因是復配穩定劑間產生協同作用，使體系具有更好的均一穩定性。

圖5-C為貯藏7 d時未復配樣品的圖像，與圖5-A相比蛋白絮凝現象更為明顯；圖5-D中蛋白質粒徑無明顯增加，聚集現象得到改善，但均一性比圖5-B差，出現上述現象的原因可能是乳酸菌造成酸乳體系后酸化，部分蛋白質結構“塌陷”，空間位阻效應減弱，空間排斥力逐漸小于范德華吸引力，出現聚集，體系失穩沉淀。

3 結論

CMC-Na、HMP和GA三種穩定劑及其添加量對核桃粕多肽酸乳飲料感官、穩定性、黏度和粒徑的影響各不相同，總體表現為添加了穩定劑綜合評分、黏度均顯著上升，體系呈最穩狀態時樣品的平均粒徑較未添加穩定劑時顯著減小。

復配穩定劑的穩定效果優于單一穩定劑，CMC-Na、HMP和GA三種穩定劑復配提高了核桃粕多肽酸乳飲料的穩定性，改善了口感，以添加1.2 g/L CMC-Na、0.9 g/L HMP、70 g/L GA時效果最佳。

經對添加復配穩定劑前后的核桃粕多肽酸乳飲料樣品的流變學特性研究，樣品添加復配穩定劑后由牛頓流體轉變為非牛頓流體，黏度增加蛋白質絮凝減少，產品穩定性提高。