蜂蜜接合酵母協同傳統曲種發酵廣東黃酒的工藝研究

彭立影，劉功良*，許瑩瑩，余潔瑜，白衛東*，賈愛娟，何松貴

1(仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州，510225) 2(廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東 中山，528437)3(廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山，528203)

黃酒，是用糯米、黍米等為原料，加入酒曲、酒母等糖化發酵劑釀制而成的一種發酵酒，與啤酒、葡萄酒并稱為世界三大古酒[1-3]。黃酒富含多種氨基酸、微量元素、有機酸等營養物質[4-6]，有抗衰老、降血壓、降膽固醇和免疫調節等作用[7-10]。我國傳統的黃酒主要以甜型和半甜型為主，隨著人們保健意識的提高，低糖型黃酒的開發成為相關研究人員關注的熱點。酵母菌在黃酒釀造過程中起著至關重要的作用，傳統釀造的客家黃酒糖化程度高，過高的糖度抑制酵母的生長繁殖，從而抑制酒精度的提高。抗逆性能優良的酵母菌能夠提升黃酒的品質，具有很大的研究價值[11-12]。

楊魯君[13]利用高糖環境(40%糖濃度的培養基)從發酵醪液中篩選到優良菌株F-18，該菌株在產酒精量上和工廠菌株相差不多，產酒率高于工廠菌株，且總酸、氨態氮和非糖固形物也高于工廠菌株，但總糖含量與工廠菌株基本上相差不多。夏艷秋等[14]對原始菌株YS分別采用乙醇-熱沖擊法、細胞紫外誘變法和原生質體紫外誘變法，結合高溫馴育進行選育，篩選到1株在38 ℃能正常生長發酵的黃酒酵母突變株YS6.2.5，該菌株在30 ℃時產酒精能力、酒精耐性、高糖耐性分別為9.0%、19%、30 °Bx，38 ℃時相應指標分別為6.5%、20%、28 °Bx。謝廣發等[15]采用TTC法、CO2失重法及釀酒試驗，篩選出菌種GY-9，并把該菌種投入到黃酒生產，發現該菌種能縮短發酵周期，提高黃酒的酒精度。

本研究在黃酒生產過程中添加蜂蜜接合酵母LGL-1，該菌株能更好地在高糖環境下發酵產酒精，可提高酒精發酵的效率。將該酵母應用于廣東黃酒釀造中，可得到糖度低、酒精度高、口味醇厚的黃酒。為確定酵母的最佳添加量、添加時間以及水添加量和前發酵時間，借助Design-Expert軟件設計中心復合試驗設計組合設計法(central composite design，CCD)設計響應面試驗，對生產工藝進行優化，以期提高設備利用率及經濟效益，為工業化生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒曲、麥曲、紅曲：河源黃龍紫金酒業有限公司提供；白糯米：市售；麥芽汁培養基：廣東凱瑞微生物科技有限公司；蜂蜜接合酵母LGL-1：仲愷農業工程學院實驗室篩選出的耐高糖酵母菌株。

HZQ-C空氣浴振蕩器，哈爾濱市東明醫療儀器廠；JJ600精密電子天平，常熟雙杰測試儀器廠；722-G紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；DHP-9602恒溫培養箱，上海-恒科學儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；酒精比重計(0～50%)，余姚市方橋試驗儀表廠。

1.2 方法

1.2.1 黃酒釀造的工藝流程[16-18]

1.2.2 蜂蜜接合酵母LGL-1生長曲線的測定

從低溫保藏酵母中挑取兩環接種于70 °Bé麥芽汁培養基的試管中，在28 ℃、170 r/min的搖床中培養2 d，然后將蜂蜜接合酵母LGL-1全部轉移到相同培養基的錐形瓶中于相同環境下繼續培養。

采用比濁法對酵母菌生長曲線進行測定。每隔6 h取2 mL菌懸液，將比色皿置于紫外可見分光光度計560 nm處測量OD值，對照組為不加酵母菌的麥芽汁培養基。以酵母菌培養時間為橫坐標，酵母菌懸菌液OD值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.3 理化指標測定

總糖、酒精度：均參照GB/T 13662—2018《黃酒》[1]國家標準中規定的方法測定。

1.2.4 影響黃酒發酵工藝的單因素試驗

1.2.4.1 酵母添加量對廣東黃酒發酵的影響

固定酵母添加時間(即添加酵母時黃酒發酵的時間)為48 h，前發酵時間為7 d，不加水，100 g干米中分別添加酵母0、2、3、4、5、7、9 mL。以糖度和酒精度為指標考察酵母添加量對黃酒的影響。

1.2.4.2 酵母添加時間對廣東黃酒發酵的影響

固定酵母添加量為4 mL，前發酵時間為7 d，不加水，分別選取酵母添加時間為42、48、54、60、66、72 h。 以糖度和酒精度為指標考察酵母添加時間對黃酒的影響。

1.2.4.3 水添加量對廣東黃酒發酵的影響

固定酵母添加量為4 mL，酵母添加時間為54 h，前發酵時間為7 d，分別選取加水量為干米總質量的0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%。以糖度和酒精度為指標考察水添加量對黃酒的影響。

1.2.4.4 前發酵時間對廣東黃酒的影響

固定酵母添加量為4 mL，酵母添加時間為54 h，加水量為70%，分別選取前發酵時間為6、7、8、9、10、11、12 d。以糖度和酒精度為指標考察前發酵時間對黃酒的影響。

1.2.5 響應面優化黃酒發酵工藝

在單因素試驗結果的基礎上，借助Design-Expert軟件，采用中心復合試驗設計原理，選取酵母添加量(A)、酵母添加時間(B)、水添加量(C)和前發酵時間(D)為響應面優化的考察量，以酒精度(Y)為響應值，設計4因素3水平的響應面試驗對黃酒發酵工藝進行優化。響應面試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

2 結果與分析

2.1 蜂蜜接合酵母LGL-1生長曲線的測定

由圖1可知，在培養基糖度為700 g/L時，0～20 h 是蜂蜜接合酵母LGL-1的遲滯期，酵母數量增長緩慢，20 h左右進入對數生長期，50 h后基本進入穩定期，該酵母遲滯期相對較短，對數生長期和穩定期較長，運用于實際生產中可節約一定的成本。綜上所述，選擇50 h作為蜂蜜接合酵母LGL-1的最佳培養時間，即蜂蜜接合酵母LGL-1培養50 h后加入黃酒中發酵。

圖1 蜂蜜接合酵母LGL-1的生長曲線Fig.1 Growth curve of Zygosacharomyces mellis LGL-1

2.2 單因素實驗結果及分析

2.2.1 酵母添加量對廣東黃酒的影響

圖2 酵母添加量對廣東黃酒糖度和酒精度的影響Fig.2 Effect of the Zygosacharomyces mellis LGL-1 addition on the sugar content and alcohol content of yellow rice wine

圖2是酵母添加量與黃酒糖度和酒精度的關系曲線圖。由圖可知，當酵母添加量低于5 mL時，隨著酵母添加量的增加，黃酒含糖質量濃度呈現下降趨勢；當酵母添加量增加到5 mL時，黃酒含糖質量濃度達最低值；當酵母添加量高于5 mL時，隨著酵母添加量的增加，黃酒含糖質量濃度升高。當酵母添加量低于4 mL時，隨著酵母添加量的增加，黃酒酒精度不斷增加；當酵母添加量為4 mL時，黃酒酒精度達到最大值，此時黃酒的含糖質量濃度為313.9 g/L，酒精度為8%vol；當酵母添加量高于4 mL時，酵母添加量增加，黃酒酒精度下降。推測可能前期酵母菌由于營養充足而快速生長繁殖，到后期發酵體系營養供應不足，酵母菌無氧呼吸作用被抑制導致生成酒精減少，且發酵過程中部分乙醇被代謝生成乙酸參與乙酯類化合物的形成，導致酒精濃度降低[19]。因此，確定酵母的最優添加量為4 mL。

2.2.2 酵母添加時間對廣東黃酒的影響

圖3是酵母添加時間與黃酒糖度和酒精度的關系曲線圖。由圖3可知，糖化42～54 h，隨著酵母添加時間越晚，黃酒含糖質量濃度呈現降低趨勢。當糖化至54 h 時，黃酒含糖質量濃度達到最低值。糖化54～72 h， 酵母添加時間越晚，黃酒含糖質量濃度越高。從圖中可知，糖化42～66 h，黃酒酒精度在8%vol附近波動，變化不大。此結果與崔闖等[20]研究糖化時間對小米黃酒糖度的影響一致。因此，選擇酵母的最佳添加時間為54 h。

圖3 酵母添加時間對廣東黃酒糖度和酒精度的影響Fig.3 Effect of the Zygosacharomyces mellis LGL-1 adding time on the sugar content and alcohol content of yellow rice wine

2.2.3 水添加量對廣東黃酒的影響

圖4是水添加量對黃酒糖度和酒精度的關系曲線圖。由圖4可知，前發酵7 d，隨著水添加量的增加，黃酒含糖質量濃度降低，且下降趨勢接近于線性關系，黃酒酒精度呈緩慢上升趨勢。高糖度會抑制酵母菌的生長，引起細胞內水分活度和細胞質組成發生顯著變化，酵母菌的細胞膜及菌體內的酶受到破壞，不利于將糖分轉化成酒精。在糖化后加入一定的無菌水，可減少高滲透壓對酵母菌的抑制作用，提高出酒率[21]。賴櫻花等[22]研究水添加量對黃酒質量的影響，分析得到隨著水添加量的增加，黃酒糖度呈現下降趨勢。因此，選擇70%(質量分數)為最佳的水添加量，此時黃酒含糖質量濃度達到最低值104.3 g/L，酒精濃度達到最高值11%vol。

圖4 水添加量對廣東黃酒糖度和酒精度的影響Fig.4 Effect of the water’s additionon the sugar content and alcohol content of yellow rice wine

2.2.4 前發酵時間對廣東黃酒的影響

圖5是前發酵時間對黃酒糖度和酒精度的關系曲線圖。由圖5可知，隨著前發酵時間的增加，黃酒含糖質量濃度不斷降低，直至第8天后，黃酒含糖質量濃度下降趨勢較平緩。

圖5 前發酵時間對廣東黃酒糖度和酒精度的影響Fig.5 Effect of the pre-fermentaition time on the sugar content and alcohol content of yellow rice wine

前發酵過程中，黃酒酒精度不斷上升，到第8天時，酒精度上升緩慢趨于平緩。徐艷等[23]研究發酵時間對黃酒的影響，分析得到黃酒在10～25 d，總糖的產生量隨著時間的增加而減少，然后趨于穩定；酒精度在發酵時間為10～25 d呈線性增加趨勢，25 d后有所下降。因此，確定最佳的前發酵時間為8 d。

2.3 響應面法優化發酵工藝試驗結果與分析

按CCD中心復合試驗方案進行4因素3水平試驗，試驗結果見表2。

表2 響應面分析方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

對表2中的試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到酵母添加量(A)、酵母添加時間(B)、水添加量(C)、前發酵時間(D)的回歸模型方程為：

Y=10.78+0.5A-0.1B+0.97C+0.3D+0.31AB+0.24AC-0.21AD-0.038BC+0.31BD-0.012CD-0.097A2-0.50B2+0.1C2-0.3D2

采用Design Expert軟件對表2的數據進行回歸分析，預測黃酒發酵的最優工藝參數，方差分析結果見表3。

由表3可知，回歸模型具有顯著性(P<0.05)，失擬差不顯著(P=0.126 9>0.05)，說明廣東黃酒酒精度模型和實際情況擬合度較好，因此可用該數學模型對試驗結果進行預測。4個因素對酒精度的影響大小依次為C(水添加量)>A(酵母添加量)>D(前發酵時間)>B(酵母添加時間)。從表3可知，AB、AC、AD和BD的相互作用具有顯著性，其響應面曲面圖見圖6。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注：*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；#，差異不顯著(P>0.05)。

a-酵母添加量與添加時間；b-酵母添加量與水添加量;c-酵母添加量與前發酵時間;d-酵母添加時間與前發酵時間圖6 各因素交互作用的響應曲面和等高線Fig.6 Diagrams of response surface and contour of the interactions between each factor

由圖6可直觀反映出酵母添加量(A)、酵母添加時間(B)、水添加量(C)和前發酵時間(D)之間交互作用對廣東黃酒酒精度的影響。當等高線呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著，呈橢圓形或馬鞍形時表示兩因素交互作用顯著[24-25]。圖6中的等高線均成明顯的橢圓形，說明AB、AC、AD以及BD相互作用對廣東黃酒酒精度有顯著影響(P<0.05)。

2.4 黃酒發酵工藝驗證試驗結果及分析

通過響應面法得到廣東黃酒發酵最優工藝條件：酵母添加量4 mL、酵母添加時間54 h、水添加量70%(質量分數)、前發酵時間8 d。根據所建立的數學模型，可得到最大響應值時的15個最優條件。將這15個試驗條件和正交實驗中最佳結果的試驗條件(試驗17)一起組成驗證實驗，以得到廣東黃酒的最佳工藝條件。驗證試驗條件和結果見表4。

表4 驗證試驗條件和結果Table 4 The conditions and results of validation test

由表4可知，試驗3的黃酒酒精度最高，該條件下，黃酒酒精度為11.7%vol。因此，確定黃酒的最佳釀造工藝條件為：酵母添加量4 mL、酵母添加時間50 h、 水添加量78%(質量分數)、前發酵時間8.4 d，該條件下，含糖質量濃度為95.6 g/L，酒精度為11.7%vol。

3 結論

本研究首先通過單因素試驗分別考察酵母添加量、酵母添加時間、水添加量和前發酵時間對廣東黃酒糖度和酒精度的影響，在此基礎上，采用響應面法對廣東黃酒發酵工藝進行優化，得到較優的發酵工藝條件，并進行驗證實驗，最后得到廣東黃酒的最佳發酵工藝條件：酵母添加量4 mL(100 g干米中)、酵母添加時間50 h、水添加量78%、前發酵時間8.4 d，此條件下得到的黃酒含糖質量濃度和酒精度分別為95.6 g/L和11.7%vol。可見，以蜂蜜接合酵母LGL-1協同傳統曲種發酵廣東黃酒為低糖型黃酒的開發提供了一定的理論依據及技術支持。