過量表達purC基因對Lactococcus lactis NZ9000酸脅迫抗性的影響

楊佩珊，張娟*，劉為佳，朱政明，堵國成

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

乳酸菌可發酵糖類并產生以乳酸為主的代謝產物，其屬于厭氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性菌[1]，大多數乳酸菌作為重要的工業微生物，廣泛應用于醫藥、食品、精細化工等領域中[2-4]。乳酸菌在上述應用中會面臨多種環境脅迫，比如酸、冷凍、滲透壓、氧等[5]，酸脅迫是其中影響乳酸菌存活能力最嚴重的挑戰之一。乳酸的過量積累使乳酸菌遭受嚴重的酸脅迫，影響菌株的正常生長和代謝，從而進一步抑制乳酸菌益生功能的發揮，因此，提高乳酸菌抵抗酸脅迫的能力尤為迫切[6-7]。

目前，提高乳酸菌酸脅迫抗性的策略主要有預適應及交叉保護[8-9]、適應性進化[10-11]、外源添加保護劑[12]和代謝工程改造抗酸元器件[13-14]等。其中抗酸元器件包括一些具有抗酸功能的關鍵基因、應激蛋白和代謝途徑等。酸脅迫條件下，乳酸乳球菌可以通過檸檬酸代謝生成乙偶姻、丁二醇和乙二酰等，這些產物能夠幫助細胞抵御酸脅迫[15]。氨基酸是維持細胞正常生長代謝的重要原料物質之一，其在乳酸菌的生長代謝和抵抗酸脅迫中，發揮著重要的作用。外源添加天冬氨酸可有效提高乳酸乳球菌和干酪乳桿菌對酸脅迫的耐受性[16-17]，張夢汝等[18]通過添加亮氨酸提高了乳酸乳球菌在pH 4.0酸脅迫環境中的存活率，研究表明，酸脅迫條件下乳酸菌可以通過調節氨基酸如天冬氨酸和亮氨酸的代謝方式提高細胞酸耐受性能。目前，關于乳酸菌中酸脅迫耐受性提升的研究主要集中于氨基酸代謝途徑，而關于其他類型代謝途徑在幫助乳酸菌細胞提升酸脅迫耐受性方面的研究相對較少。嘌呤核苷酸對能量代謝和各種合成代謝過程如DNA、RNA和蛋白質合成有著至關重要的作用[19]，調控嘌呤代謝可在一定程度緩解非生物脅迫的侵擾[20]。目前，有關嘌呤代謝途徑在改善乳酸乳球菌酸脅迫抗性方面的研究還非常有限，僅有的研究發現，嘌呤代謝中的PurA和GuaB催化轉化腺苷和鳥苷一磷酸(AMP和GMP)有利于乳酸乳球菌抵御氧脅迫和酸脅迫[21-22]。

編碼磷酸核糖基氨基咪唑-琥珀酰胺合酶的purC是IMP生物合成途徑的關鍵基因，本身也是嘌呤代謝的一部分，該基因能夠催化轉化CAIR(羧酰氨基咪唑核糖核苷酸)生成SAICAR(琥珀酰氨基咪唑甲酰胺核苷酸)。研究發現，purC基因沉默會引起嘌呤代謝水平改變，產生嘌呤代謝產物的缺陷可導致細菌生長延緩[23]。本文通過在L.lactisNZ9000中過表達嘌呤代謝途徑中的purC基因，考察了重組菌株生長能力和存活能力，通過檢測胞內ATP和氨基酸含量，研究重組菌株耐受酸脅迫的具體生理響應機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及培養條件

大腸桿菌E.coliMC1061，實驗室保藏；乳酸乳球菌L.lactisNZ9000 (保藏編號：LLN，CP002094；荷蘭“NIZO Food Research”奶制品研究所)；質粒pNZ8148，德國MoBiTec公司；E.coliMC1061在LB培養基(10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L NaCl)中37 ℃，220 r/min振蕩培養；L.lactisNZ9000在GM17培養基(M17培養基中添加5 g/L的葡萄糖)于30 ℃恒溫培養箱靜置培養。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母粉和M17肉湯培養基，Oxoid公司；NcoI、HindⅢ快速內切酶和GeneJET PCR純化試劑盒，Thermo Scientific公司；Solution I、PrimerSTAR HS (Premix)，大連寶生物工程有限公司；SanPrep柱式質粒小量抽提試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司；nisin，Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒，天根生化科技有限公司；ATP測定試劑盒，碧云天生物技術研究所；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

恒溫培養箱，上海醫療器械研究所；組織和細胞勻漿儀，MP Biomedicals公司；M-100生物傳感器分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技(中國)有限公司；多功能酶標儀，Thermo Scientific公司；凝膠成像儀、電轉化儀，Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 目的片段的擴增及純化

根據NCBI數據庫公布的磷酸核糖基氨基咪唑-琥珀酰胺合成酶PurC基因序列并利用Primer Primier 5.0設計引物purC-F和purC-R(表1)，上、下游引物的5′端分別加入NcoI和HindⅢ兩個酶切位點(引物中劃線部分)。

表1 用于質粒構建的引物Table 1 Primers used for plasmid construction

以L.lactisNZ9000的基因組為模板，通過PCR擴增獲得purC基因。PCR反應體系：2×Prime STAR HS (Premix) 25 μL，purC-F和purC-R(10 μmol/L)各1 μL，L.lactisNZ9000的基因組模板1 μL，無菌水22 μL。反應條件：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s；55 ℃、15 s； 72 ℃、1 min，30個循環，使用10 g/L的瓊脂糖凝膠核酸電泳初步確定，并進行膠回收獲得目的基因片段。

1.3.2 表達載體的構建

將PCR產物以及質粒pNZ8148采用限制性內切酶NcoI和HindⅢ 同時進行雙酶切，并純化回收。將酶切的PCR產物以及pNZ8148使用Solution I連接酶16 ℃ 過夜連接。連接產物通過熱激法轉入E.coliMC1061感受態中，轉化后的重組子涂布于含有100 μg/mL 氯霉素的LB固體培養基中，37 ℃培養12 h。挑取氯霉素平板上的轉化子進行菌落PCR驗證。將獲得的菌體進行培養，提取pNZ8148-purC重組質粒，進行雙酶切驗證，測序驗證。通過電轉化的方式將測序成功的重組質粒和空質粒轉入L.lactisNZ9000，并通過菌落PCR驗證和10 μg/mL的氯霉素抗性篩選獲得重組菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)和對照菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148)。

1.3.3 重組菌株生長曲線的測定和乳酸發酵實驗

將菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)和L.lactisNZ9000 (pNZ8148)接種于加了10 μg/mL氯霉素的GM17液體培養基中進行活化，放在30 ℃培養箱中靜置培養過夜。再以2%的接種量將種子液轉接至含有氯霉素(10 μg/mL)的GM17液體培養基中，30 ℃靜置培養。每隔一定時間取樣，培養至OD600=0.4時加入10 ng/mL的nisin誘導表達PurC蛋白，測定OD600 nm值，使用生物傳感器分析儀測定各個時間點的葡萄糖質量濃度和乳酸產量。以時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制生長曲線。以時間為橫坐標，葡萄糖質量濃度和乳酸產量為縱坐標，繪制重組菌株和對照菌株的乳酸發酵曲線。

1.3.4 脅迫條件下重組菌株酸脅迫抗性的分析

在含有10 μg/mL氯霉素的GM17培養基中培養重組菌株和對照菌株至OD600約為0.4，加入10 ng/mL的nisin誘導蛋白表達，待菌株生長至對數中后期，離心(8 000 r/min)3 min，使用8.5 g/L生理鹽水等體積洗滌2次、離心、收集菌體，重懸于等體積的GM17培養基中(乳酸調節，pH 4.0)。隨后于0、1、2、3、4 h各取900 μL菌液，離心，等體積洗滌并進行梯度稀釋，取10 μL合適梯度的重懸液點種于GM17固體平板上，30 ℃下培養24 h，活菌計數并計算存活率[24]。

1.3.5 脅迫條件下重組菌株胞內ATP和氨基酸含量的測定

nisin誘導蛋白表達后，重組菌株和對照菌株生長至對數中后期，離心(8 000 r/min)4 min，使用8.5 g/L 生理鹽水等體積洗滌2次、離心、收集菌體，重懸于等體積的GM17培養基中(pH 4.0)，脅迫一定時間取樣，收集菌體，破碎細胞，取細胞破碎液測定胞內ATP和氨基酸。選用ATP測定試劑盒測定胞內ATP，高效液相色譜儀測定胞內氨基酸[25]。

1.3.6 蛋白濃度的測定

蛋白濃度測定采用BCA蛋白濃度測定試劑盒，具體按說明書操作。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的構建

以L.lactisNZ9000基因組為模板，利用引物purC-F和purC-R進行目的片段的擴增，得到目的PCR產物，核酸電泳結果顯示，目的基因條帶單一，與理論711 bp大小符合(圖1)。

圖1 目的基因purC的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of gene purC

按照1.3.2的方式構建重組質粒pNZ8148-purC，結果如圖2所示。將上述獲得的重組質粒導入到E.coliMC1061的感受態細胞中，挑取經菌落PCR驗證的陽性克隆子培養并提取質粒，采用NcoI和HindⅢ進行雙酶切驗證，核酸電泳結果顯示，目標條帶在500～750 bp，與已知目的片段大小711 bp相符合，其雙酶切驗證結果如圖3所示。將驗證成功的重組質粒進行測序驗證，并電轉入感受態L.lactisNZ9000，獲得重組菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)。

圖2 重組質粒pNZ8148-purC的構建Fig.2 Construction of recombinant plasmid of pNZ8148-purC

圖3 重組質粒pNZ8148-purC雙酶切驗證Fig.3 Identification of recombinant plasmid pNZ8148-purC by digestion with restriction endonuclease

2.2 重組菌株的生長曲線和乳酸發酵性能測定

為了研究purC基因的過表達對L.lactisNZ9000生長性能的影響，實驗測定了對照菌株和重組菌株在初始pH 7.0條件下的生長曲線。由圖4可知，重組菌株與對照菌株生長狀態基本一致，說明purC的過表達并未影響L.lactisNZ9000的正常生長。

圖4 L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC)和L. lactis NZ9000 (pNZ8148)的生長性能Fig.4 Growth curves of L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC) and L. lactis NZ9000 (pNZ8148)

乳酸菌主要依靠乳酸等有機酸代謝產物來發揮益生功能，提高乳酸菌酸脅迫耐受性的前提應是確保其正常的乳酸產量，為了進一步考察在初始pH 7.0條件下，重組菌株及對照菌株的發酵情況，作者對菌株的乳酸產量和葡萄糖消耗進行測定。由圖5可知，隨著菌株生長時間的延長，葡萄糖殘留量逐漸降低，乳酸產量逐漸提高，并且菌株生長至8 h后葡萄糖與乳酸含量均趨于平緩。重組菌株的乳酸產量和葡萄糖消耗與對照菌株相比沒有明顯的區別。說明表達purC基因并未影響重組菌株的正常發酵生產。

圖5 L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC)和L. lactis NZ9000 (pNZ8148)的葡萄糖和乳酸發酵曲線Fig.5 The concents of glucose and lactic acid of L. lactisNZ9000 (pNZ8148-purC) and L. lactis NZ9000 (pNZ8148)

2.3 脅迫條件下重組菌株的存活率測定

上述實驗結果表明，過量表達purC基因并未影響重組菌株的正常生長和發酵生產。為了進一步考察過表達purC基因對菌株酸脅迫抗性的影響，對L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)和L.lactisNZ9000 (pNZ8148)進行乳酸脅迫培養實驗，測定菌株的存活率。L.lactis生長的最適pH接近中性，隨著其主要代謝產物乳酸產量的積累，胞外pH逐漸下降，最低可降至pH 4.5～5.0[26]，而在pH 4.0的脅迫環境下，L.lactis的存活率下降最為明顯，因此本實驗選擇pH 4.0作為酸脅迫條件來研究L.lactis的存活率及相關生理指標[27]。如圖6所示，為培養在GM17(pH 7.0)培養基中的L.lactisNZ9000經pH 4.0脅迫后存活率的變化情況。

圖6 脅迫條件下L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC)與L. lactis NZ9000 (pNZ8148)的存活率Fig.6 The survival rates of L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC) and L. lactis NZ9000 (pNZ8148) under acid stress

由圖6可知，過量表達了purC基因的L.lactisNZ9000經pH 4.0脅迫處理后的存活率明顯高于未表達purC基因的L.lactisNZ9000，且隨著時間的延長，兩者之間存活率的差距變大。經pH 4.0脅迫培養3 h后，重組菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)的存活率是對照菌株的12.3倍，而在pH 4.0脅迫培養4 h后，重組菌株的存活率是對照菌株的83.2倍，結果表明，通過基因工程手段過表達purC基因能明顯提高L.lactisNZ9000的酸脅迫抗性(圖6)。

2.4 脅迫條件下重組菌株胞內ATP含量的測定

當乳酸菌在酸脅迫環境的情況下，維持胞內pH的平衡最主要的應對方式之一是將胞內的H+排出到胞外，此過程是1個耗能的過程，需要消耗大量ATP來產生能量。因此實驗考察了酸脅迫條件下菌株胞內ATP濃度的變化(圖7)。在pH 4.0脅迫0、1、3 h，胞內ATP含量分別為對照菌株的4.8、6.3和4.3倍，重組菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)與對照菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148)相比保持了相對較高的ATP濃度，因此，重組菌株可以釋放更多的ATP，滿足脅迫條件下細胞對能量的需求，從而提高細胞的酸脅迫抗性。

圖7 脅迫條件下L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC)和L. lactis NZ9000 (pNZ8148)胞內ATP含量Fig.7 The contents of intracellular ATP pool of L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC) and L. lactis NZ9000 (pNZ8148) under acid stress

2.5 脅迫條件下重組菌株胞內氨基酸含量的測定

氨基酸作為細胞生長代謝的關鍵營養成分，是多種大分子如蛋白質、脂肪酸、核酸等合成的重要原料物質之一，其還可以在酶的催化作用下生成與細胞能量代謝相關的中間產物[28]。一些氨基酸如天冬氨酸和蘇氨酸可以參與嘌呤合成[29]，在乳酸乳球菌中，嘌呤代謝與氨基酸代謝之間的聯系如圖8所示，從圖中可以看出，嘌呤代謝途徑可以促進ATP的合成，同時與一些氨基酸的合成如天冬氨酸(aspartate)、谷氨酸(glutamate)、蘇氨酸(threonine)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)有著密切的聯系。

為了進一步研究過量表達嘌呤代謝途徑中的purC基因作用效果，測定了脅迫培養后L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)的胞內氨基酸含量。結果如圖9所示，酸脅迫前后重組菌株胞內天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)均高于對照菌株。

pH 4.0條件下脅迫2 h后重組菌株胞內Asp、Thr、Glu和GABA含量分別為對照菌株的2.1、1.7、1.8和1.4倍。

圖8 L. lactis NZ9000中嘌呤和氨基酸代謝機制Fig.8 Schematic representation of purine and amino acid pathway in L. lactis NZ9000

Asp在保護乳酸菌抵御酸脅迫過程中具有重要作用[30]，Asp生成富馬酸(fumarate)的過程中伴隨著NH3的產生，同時富馬酸能夠進一步轉化為蘋果酸，后者可以通過蘋果酸乳酸發酵途徑消耗胞內的H+，減少酸脅迫環境對乳酸菌細胞造成的損傷[31]，進而增強L.lactisNZ9000的酸脅迫抗性[32]。Thr在蘇氨酸脫氨酶的作用下可釋放NH3中和H+[33]。氨基酸脫羧是乳酸菌抵御酸脅迫的一種重要途徑，乳酸菌可以通過脫羧產生CO2，與此同時消耗H+，從而維持胞內pH值的動態平衡。如圖8所示，Glu在谷氨酸脫羧酶催化下脫掉羧基消耗H+，并產生CO2，H+的消耗可提高胞內的pH值。同時，脫羧反應生成的GABA作為一種堿性物質可被反向轉運到胞外，進一步減輕細胞的酸脅迫壓力[34]。綜上，作者證實了在酸脅迫條件下，過量表達嘌呤代謝途徑中的purC基因，為細胞提供更多ATP的同時，重組菌株能夠產生較多的胞內天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和γ-氨基丁酸，通過生成堿性物質和消耗胞內質子的方式，維持胞內pH穩態，進而增強L.lactisNZ9000的酸脅迫抗性。

A-天冬氨酸含量；B-蘇氨酸含量；C-谷氨酸含量；D-γ-氨基丁酸含量圖9 脅迫條件下L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC)和L. lactis NZ9000 (pNZ8148)胞內氨基酸含量Fig.9 The contents of intracellular amino acids of L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC) and L. lactis NZ9000 (pNZ8148) under acid stress

3 結論

本研究利用NICE系統誘導表達PurC蛋白提高乳酸菌的酸脅迫抗性，相關研究發現，在酸脅迫條件下進行誘導表達的主要是熱休克蛋白以及與DNA修復相關的蛋白[35-36]。在乳酸乳球菌(L.lactis)中異源表達來源于大腸桿菌的熱休克蛋白DanK，工程菌對酸(體積分數0.5%乳酸，pH 5.47)的耐受性顯著提高。WU等[13]通過在L.lactisNZ9000中表達DNA修復蛋白RecO，重組菌株的存活率是對照菌株的2.9倍(pH 4.0脅迫5 h)。除此之外，部分外源功能因子在微生物細胞抵抗酸脅迫中發揮的作用也有相關報道，將L.lactis中海藻糖編碼基因trePP、pgmB及otsB在L.lactisNZ9000中進行表達，重組菌對酸脅迫(pH 3.0)的耐受性提高了5～10倍[37]。嘌呤核苷酸對能量代謝和各種合成代謝過程有著至關重要的作用[19]，嘌呤代謝途徑中的purC基因沉默會引起嘌呤代謝水平改變，影響細胞的正常生長[23]。本研究通過在L.lactisNZ9000過量表達嘌呤代謝途徑中的purC基因，在pH 4.0脅迫4 h后，重組菌株的存活率是對照菌株的83.2倍，結果表明，通過基因工程手段過表達purC基因能明顯提高L.lactisNZ9000的酸脅迫抗性。進一步研究發現，重組菌株可以在酸脅迫條件下維持更高的胞內ATP濃度和氨基酸含量，分別通過滿足細胞對能量的需求以及生成堿性物質和消耗胞內質子的方式緩解細胞受到的酸脅迫壓力，從而幫助細胞抵御酸脅迫。本文首次報道了在乳酸乳球菌中過量表達purC基因提高酸脅迫耐受性的作用效果，為進一步通過對嘌呤代謝途徑改造提高細胞酸脅迫耐受性提供了新的思路。同時，上述研究結果也對關于purC基因在其他工業微生物中的應用提供了重要的參考。