啟動(dòng)子串聯(lián)及改造提高FAD為輔基的葡萄糖脫氫酶在Bacillus subtilis中的表達(dá)

張玲，林榮，宋祖坤，王男，楊海麟*

1(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫， 214122) 2(蘇州盛迪亞生物醫(yī)藥有限公司，江蘇 蘇州， 215000)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)被廣泛應(yīng)用于血糖指標(biāo)的臨床生化檢測(cè)。近些年發(fā)現(xiàn)葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH)具有替代葡萄糖氧化酶的應(yīng)用潛力，因其不以氧氣為電子受體，不受溶解氧的限制，檢測(cè)結(jié)果誤差更小[1-2]。葡萄糖脫氫酶按照輔基或輔酶差異可分為[3]：(1)以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(hicotinamide adenine dinucleotide, NAD(P)+)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(NAD(P)-GDH,EC 1.1.1.47)。(2)以吡咯并喹啉醌(pyvrolidine quinoline quinone, PQQ)為輔基的葡萄糖脫氫酶(PQQ-GDH,EC 1.1.5.2)。(3)以黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)為輔基的葡萄糖脫氫酶(FAD-GDH，EC 1.1.99.10)。其中FAD-GDH以輔基結(jié)合緊密，催化效率較高，可作為替代目前診斷用葡萄糖氧化酶的首選。

具有活性的FAD-GDH可能為單體[4]或同源二聚體[5]。FAD-GDH主要來(lái)源于絲狀真菌[6]，如：Penicilliumsp.[7]，Mucorsp.[8]，Aspergillussp.[9-10]，Glomerellacingulata[11]等，重組表達(dá)和純化較為困難。來(lái)源于Glomerellacingulata的FAD-GDH在E.coli中重組表達(dá)，常常需要與分子伴侶系統(tǒng)共表達(dá)才能實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，蛋白純化和放大生產(chǎn)較為困難[11]。在酵母菌中表達(dá)量較高，但存在糖基化修飾，會(huì)干擾血糖檢測(cè)電極的靈敏度，實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中需進(jìn)行酶的去糖基化步驟[12]。

FAD-GDH罕見(jiàn)于細(xì)菌。本團(tuán)隊(duì)先前嘗試將來(lái)源于細(xì)菌Burkholderiacepacia的FAD-GDH基因(gdh)在大腸桿菌中表達(dá)，該酶熱穩(wěn)定性好，Tm值可達(dá)77 ℃。為了探索該基因在其他宿主的表達(dá)情況，本文嘗試將來(lái)源于原核Burkholderiacepacia的gdh基因在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主，遺傳背景清楚，對(duì)培養(yǎng)基要求較低，生長(zhǎng)快速，不產(chǎn)內(nèi)毒素，適用于原核生物來(lái)源重組蛋白的分泌表達(dá)。

篩選高效的啟動(dòng)子可實(shí)現(xiàn)外源基因在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)。啟動(dòng)子依據(jù)是否需要誘導(dǎo)分為：(1)組成型啟動(dòng)子，如P43，PHpaⅡ，PamyQ’;(2)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如Popuaa，Pgsib。組成型的啟動(dòng)子能在菌體內(nèi)持續(xù)進(jìn)行基因表達(dá)，受環(huán)境因素的影響較少，或變化很小。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在誘導(dǎo)因子存在下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)，積累目的產(chǎn)物[13]。許多研究表明雙啟動(dòng)子相比單啟動(dòng)子更能促進(jìn)外源基因的表達(dá)。重組菌株B.subtilisCCTCCM 2016536用于表達(dá)β-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，雙啟動(dòng)子PHpaⅡ-PamyQ’表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量是單個(gè)啟動(dòng)子PamyQ’表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量的1.3倍，主要由于雙啟動(dòng)子下外源基因轉(zhuǎn)錄水平高于單啟動(dòng)子[14]。啟動(dòng)子PAmyR2和啟動(dòng)子Pblma分別插入PHpaII啟動(dòng)子的下游，4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量和單啟動(dòng)子PHpaII比較分別提高11、12倍[15]。雙啟動(dòng)子PHpaII-PgsiB表達(dá)氨肽酶分別是單個(gè)PHpaII和PgsiB啟動(dòng)子表達(dá)的2.3和2.2倍[16]。

將啟動(dòng)子突變改造也是提高枯草芽孢桿菌產(chǎn)物積累的有效辦法。碳源代謝在菌體發(fā)酵過(guò)程中占有重要地位，表達(dá)外源產(chǎn)物的過(guò)程中碳代謝產(chǎn)物例如葡萄糖等，會(huì)對(duì)目的產(chǎn)物的生成產(chǎn)生抑制作用，即碳代謝產(chǎn)物抑制(carbon catabolite repression,CCR)，這種抑制作用主要是通過(guò)碳代謝控制蛋白A (carbon catabolite protein A,CcpA) 復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域的cre位點(diǎn)抑制轉(zhuǎn)錄[17]。cre位點(diǎn)的突變可有效地減少CcpA介導(dǎo)的碳代謝抑制作用。NICHOLSON等通過(guò)隨機(jī)突變篩選得到抗碳代謝產(chǎn)物的淀粉酶生產(chǎn)菌株，經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)amyE啟動(dòng)子的cre序列中GC堿基突變成AT[18]。NAGARAJAN等克隆來(lái)自高產(chǎn)淀粉酶的BacillussubtilisKCC103菌株的啟動(dòng)子amyR4，該啟動(dòng)子能夠有效地抵抗碳代謝產(chǎn)物的抑制，實(shí)現(xiàn)異源蛋白的高效表達(dá)，序列研究表明啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游cre序列中+4(C-T)，-7(T-A)堿基發(fā)生突變[19]。

本研究嘗試將Burkholderiacepacia的FAD-GDH基因(gdh)在蛋白酶缺陷型菌株B.subtilisWB600中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)啟動(dòng)子篩選、串聯(lián)及改造等策略，以期獲得FAD-GDH高表達(dá)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

葡萄糖脫氫酶基因(gdh)由南京金斯瑞合成，構(gòu)建于載體pUC57；E.coliJM109，B.subtilis168，B.subtilisWB600菌株由實(shí)驗(yàn)室保存(表1)。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶、蛋白質(zhì)Low Marker、DNA Marker均購(gòu)自大連寶生物有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工股份有限公司；其他所用試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及緩沖液

(1) LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，加入2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂即為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基。(2) TB培養(yǎng)基(g/L)：甘油4.0，酵母粉24.0，蛋白胨12.0，溶解在800 mL去離子水中，高壓滅菌后冷卻至40 ℃加入200 mL滅菌的緩沖液(K2HPO416.4 g，KH2PO42.32 g，溶解于去離子水中，定容至200 mL，0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌)。(3) 抗 生素溶液：先配置成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的母液，然后用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌，用小的EP管分裝，置于-20 ℃ 保存。(4) 磷酸鉀緩沖液(phospate buffered,PB，50 mmol/L， pH 7.0)：取86 mL的0.1 mol/L K2HPO4，加入14 mL的0.1 mol/L KH2PO4，再加入100 mL水，調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pMA5-1的構(gòu)建

以質(zhì)粒pUC57-gdh為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入BamHⅠ/MluⅠ位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物回收雙酶切，與同樣雙酶切的質(zhì)粒pMA5連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pMA5-1。

1.2.2 串聯(lián)啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以B.subtilis168的DNA為模板，利用引物PamyQ’-F/PamyQ’-R，P43-F/P43-R，PgsiB-F/PgsiB-R, Popuaa-F/ Popuaa-R，分別PCR擴(kuò)增相應(yīng)的啟動(dòng)子序列，同時(shí)引入NdeⅠ/MluⅠ位點(diǎn)，雙酶切啟動(dòng)子序列與同樣雙酶切的質(zhì)粒pMA5-1連接，構(gòu)建雙啟動(dòng)子質(zhì)粒pMA5-1n(表2)。

1.2.3 培養(yǎng)方法

種子液的制備：從卡納抗性的固體培養(yǎng)基上，挑取重組菌B.subtilis單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)8 h。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 2 Oligonucleotides used in this study

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：以體積分?jǐn)?shù)4%轉(zhuǎn)接種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min，培養(yǎng)48 h。

1.2.4 菌體生物量測(cè)定

取20 mL不同濃度的菌液，8 000 r/min離心10 min， 用pH 7.0，50 mmol/L的PB緩沖液清洗2次，測(cè)定濕重，105 ℃烘干至恒定值，稱取干重。菌體濕重約是干重的3.8倍。

1.2.5 葡萄糖脫氫酶酶活測(cè)定及SDS-PAGE分析

酶活定義：在一定條件下，每分鐘還原1 μmol DCPIP所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

取100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，加入3 mL顯色液(50 mmol/L pH 7.0的PB緩沖液， 0.03 mmol/L的DCPIP，1.6 mmol/L的PMS，100 mmol/L的葡萄糖溶液)輕輕混勻，用重蒸水調(diào)零，37 ℃每隔1 min記錄600 nm處吸光值的變化，共記錄2～3 min。

用酶的緩沖液代替酶液作為對(duì)照。

采用5%的濃縮膠與15%的分離膠，pH 8.3的Tris-Gly電泳緩沖液，90 V恒壓，將剝離電泳后的膠，染色，脫色。膠的具體配置操作方法參照SDS-PAGE試劑盒。

1.2.6 基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

樣品處理：(1)用刀片切下膠上目標(biāo)條帶，放入離心管中；(2)加入400 μL脫色液脫色，清洗至透明，去除上清，凍干或加50 μL乙腈，放置5 min，去除乙腈，重復(fù)1次，晾干，膠粒應(yīng)為白色；(3)加入90 μL 100 mmol/L NH4HCO3，10 μL 100 mmol/L DTT，56 ℃ 放置30 min； (4)去上清，加100 μL 100%乙腈，5 min后吸去；(5)加入70 μL 100 mmol/L NH4HCO3，30 μL 200 mmol/L IAA，暗處理20 min；(6)去上清，加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3，室溫放置15 min；(7)去上清，加入100 μL 100%乙腈，5 min后吸去，凍干或加50 μL乙腈，放置5 min，去除乙腈，重復(fù)1次，晾干，膠粒應(yīng)為白色；(8)加入6 μL酶液，4 ℃放置30～60 min，使膠塊充分吸漲；(9)加入20 μL 25 mmol/L NH4HCO3緩沖液，37 ℃放置20 h左右；(10)取0.6 μL酶解液點(diǎn)樣，自然晾干，覆蓋0.6 μL基質(zhì)，晾干。進(jìn)行上機(jī)質(zhì)譜分析，并將得到的結(jié)果導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pMA5-1的構(gòu)建表達(dá)及蛋白質(zhì)譜鑒定

將gdh基因構(gòu)建到pMA5上轉(zhuǎn)入B.subtilis，研究是否能夠表達(dá)具有活性的FAD-GDH。將pMA5-1轉(zhuǎn)化E.coliJM109，經(jīng)過(guò)氨芐抗性平板篩選，從陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，利用BamHⅠ和MluⅠ雙酶切電泳驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖1，凝膠電泳條帶與目的基因大小一致，并將驗(yàn)證正確的基因測(cè)序，與目的序列比對(duì)，結(jié)果表明構(gòu)建成功。

M-DNA marker；1-pMA5-1雙酶切產(chǎn)物圖1 pMA5-1雙酶切驗(yàn)證Fig.1 Identification of pMA5-1 by restriction digestion

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pMA5-1轉(zhuǎn)入B.subtilis感受態(tài)WB600，從含有卡納抗性的平板上挑選陽(yáng)性克隆，獲得重組菌株WB1，將獲得的重組菌搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h，菌體離心收集，細(xì)胞破碎，上清離心，測(cè)得酶活為962 U/L，并將離心獲得的上清取30 μL，加入10 μL 4×SDS-PAGE的上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，由于空白對(duì)照處也存在一條60 kDa的條帶，所以將WB1破壁上清SDS-PAGE圖譜中60 kDa處的條帶切膠回收，進(jìn)行飛行質(zhì)譜分析，比對(duì)結(jié)果顯示與目的條帶匹配度最高的為來(lái)源于Burkholderiacepacia的葡萄糖脫氫酶，分子質(zhì)量60 kDa，進(jìn)一步表明FAD-GDH在B.subtilisWB600中表達(dá)成功。

M-蛋白質(zhì)marker；1-對(duì)照；WB0-破壁上清；2-WB1破壁上清圖2 B. subtilis表達(dá)FAD-GDH SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE identification of B. subtilis expression FAD-GDH

2.2 串聯(lián)啟動(dòng)子提高FAD-GDH的表達(dá)

采用雙啟動(dòng)子串聯(lián)策略來(lái)提高FAD-GDH的表達(dá)量，本文選取的啟動(dòng)子見(jiàn)表3。啟動(dòng)子PHpaⅡ是質(zhì)粒pMA5上自帶的啟動(dòng)子，本文選取其他4種啟動(dòng)子串聯(lián)在PHpaⅡ下游構(gòu)建含有雙啟動(dòng)子。其中PamyQ’和P43為組成型的啟動(dòng)子，具有強(qiáng)啟動(dòng)性、無(wú)需添加誘導(dǎo)劑可直接產(chǎn)生目的蛋白的優(yōu)勢(shì)；PgsiB和Popuaa為鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，受鹽濃度激活調(diào)控目的蛋白大量產(chǎn)生的特點(diǎn)。4種雙啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒pMA5-11(PHpaII-PamyQ’)，pMA5-12(PHpaII-P43)，pMA5-13(PHpaII-PgsiB)，pMA5-14(PHpaII-Popuaa)構(gòu)建流程見(jiàn)圖3。

以B.subtilis168基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增相應(yīng)的啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增產(chǎn)物回收雙酶切插入啟動(dòng)子PHpaII的下游，分別獲得重組質(zhì)粒pMA5-11，pMA5-12，pMA5-13，pMA5-14。利用NdeⅠ和MluⅠ雙酶切電泳驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖4，并將驗(yàn)證正確的基因測(cè)序，與目的序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明構(gòu)建成功。

分別將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pMA5-11，pMA5-12，pMA5-13，pMA5-14，轉(zhuǎn)化感受態(tài)B.subtilisWB600，從含有卡納抗性的平板上挑選陽(yáng)性克隆，獲得菌株WB11，WB12，WB13，WB14，以及含有單啟動(dòng)子PHpaⅡ的重組菌WB1，將獲得的上述重組菌與含有單啟動(dòng)子PHpaⅡ的重組菌WB1分別搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h，菌體離心收集，細(xì)胞破碎。

表3 本文所構(gòu)建的來(lái)源于B. subtilis的啟動(dòng)子Table 3 The promoter from B. subtilis used in this study

圖3 串聯(lián)啟動(dòng)子載體pMA5-1n的構(gòu)建流程Fig.3 Construction procedure of double promoter vector pMA5-1n

不同啟動(dòng)子的強(qiáng)度通過(guò)測(cè)定菌體胞內(nèi)酶活來(lái)衡量。PamyQ’和P43為組成型的啟動(dòng)子[21-23]，PgsiB和Popuaa為鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[24-26]，受鹽濃度激活，可利用質(zhì)量濃度為4 g/L的NaCl進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。含單啟動(dòng)子PHpaⅡ重組菌株WB1及4種雙啟動(dòng)子重組菌WB11，WB12，WB13，WB14的胞內(nèi)酶活分別為924、2 497、 578、740、878 U/L(圖5-a)。其中含有組成型啟動(dòng)子PamyQ’的雙啟動(dòng)子重組菌WB11 (PHpaⅡ-PamyQ’)胞內(nèi)酶活最高，約是酶活最低的重組菌株WB12的4倍，是單啟動(dòng)子PHpaⅡ表達(dá)FAD-GDH酶活的2.7倍。分別取30 μL上述離心獲得的上清加入10 μL 4×的上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5-b， 重組菌發(fā)酵液在60 kDa處都有目的蛋白產(chǎn)生。

M-DNA marker；1-pMA5-11雙酶切產(chǎn)物；2- pMA5-12雙酶切產(chǎn)物；3-pMA5-13雙酶切產(chǎn)物；4-pMA5-14雙酶切產(chǎn)物圖4 雙啟動(dòng)子載體pMA5-1n雙酶切驗(yàn)證Fig.4 Identification of double promoter vector pMA5-1n by restriction digestion

a-含雙啟動(dòng)子重組B.subtilis產(chǎn)FAD-GDH的酯活水平和菌體量；b-含雙啟動(dòng)子重組B.subtilis表達(dá)FAD-GDH的SDS-PAGE鑒定M-蛋白質(zhì)marker；1-WB1破壁上清；2-WB11破壁上清；3-WB12破壁上清；4-WB13破壁上清；5-WB14破壁上清圖5 雙啟動(dòng)子表達(dá)FAD-GDH結(jié)果及SDS-PAGE鑒定Fig.5 Result of double promoter expression FAD-GDH and SDS-PAGE identification

2.3 刪除啟動(dòng)子PamyQ’上cre位點(diǎn)促進(jìn)FAD-GDH的發(fā)酵產(chǎn)酶

上述研究中表明最佳的串聯(lián)雙啟動(dòng)子PHpaII-PamyQ’使酶活提高到2 497 U/L，具有促進(jìn)該酶表達(dá)的效果，但有研究表明PamyQ’啟動(dòng)子在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)受到葡萄糖濃度的抑制，隨著葡萄糖濃度的增加會(huì)明顯抑制產(chǎn)酶[14]。本研究先考察葡萄糖是否會(huì)嚴(yán)重抑制串聯(lián)啟動(dòng)子PamyQ’突變菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶。比較不同濃度的葡萄糖和甘油條件下該突菌變株的發(fā)酵產(chǎn)酶情況。

將改造前重組菌WB11(含有雙啟動(dòng)子PHpaII-PamyQ’)發(fā)酵培養(yǎng)48 h，收集菌體，酶活驗(yàn)證是否存在碳代謝產(chǎn)物抑制效應(yīng)。結(jié)果如圖6，通過(guò)測(cè)定酶活檢測(cè)FAD-GDH的表達(dá)情況，隨著培養(yǎng)基碳源的葡萄糖或甘油濃度的增加，菌體量上升，酶活逐漸下降。未添加葡萄糖，菌體胞內(nèi)酶活是添加30 g/L的葡萄糖培養(yǎng)菌體胞內(nèi)酶活的1.5倍；當(dāng)未添加甘油，胞內(nèi)酶活是添加3%(體積分?jǐn)?shù))的甘油胞內(nèi)酶活的2倍，說(shuō)明串聯(lián)啟動(dòng)子PamyQ’后碳源濃度增加會(huì)抑制產(chǎn)酶。

a-不同質(zhì)量濃度葡萄糖對(duì)改造前后重組菌產(chǎn)酶的影響；b-不同體積分?jǐn)?shù)甘油對(duì)改造前后重組菌產(chǎn)酶的影響圖6 改造前后重組菌產(chǎn)FAD-GDH水平及菌體生長(zhǎng)情況Fig.6 FAD-GDH expression and cell growth of reconstituted bacteria before and after transformation

枯草芽孢桿菌中，碳代謝產(chǎn)物的抑制效應(yīng)主要是通過(guò)碳代謝控制蛋白CcpA，結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域的cre位點(diǎn)抑制轉(zhuǎn)錄。cre位點(diǎn)是一段含有回文結(jié)構(gòu)，存在一些堿基保守的序列。CcpA如何與多樣的cre位點(diǎn)結(jié)合，具體的機(jī)制還不清楚，但改造和移除該位點(diǎn)可有效減少碳代謝的抑制[18-19]。

為了減少碳代謝產(chǎn)物的抑制效應(yīng)，基于雙啟動(dòng)子PHpaII-PamyQ’，通過(guò)重疊延伸PCR[27]移除PamyQ’啟動(dòng)子中14個(gè)核苷酸的cre位點(diǎn)，構(gòu)建雙啟動(dòng)子PHpaII-PamyQ2，轉(zhuǎn)入B.subtilisWB600，構(gòu)建WB2重組菌，發(fā)酵培養(yǎng)基添加30 g/L的葡萄糖，菌體胞內(nèi)酶活力達(dá)3 626 U/L， 約是啟動(dòng)子改造前添加30 g/L的葡萄糖菌體胞內(nèi)酶活的2.2倍。如圖7-b重組菌株WB2發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2%(體積分?jǐn)?shù))的甘油菌體胞內(nèi)酶活力達(dá)3 119 U/L，是改造之前重組菌株WB11添加2%的甘油菌體胞內(nèi)酶活的2.1倍。重組菌株WB111發(fā)酵培養(yǎng)中添加3%的甘油胞內(nèi)酶活比添加2%的甘油有所下降，可能是過(guò)多的碳源導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過(guò)快，抑制重組蛋白表達(dá)。

為了驗(yàn)證改造后的重組菌WB2，培養(yǎng)時(shí)添加高濃度的葡萄糖是否會(huì)抑制FAD-GDH的表達(dá)，向培養(yǎng)基中分別添加40、50、60、70 g/L的葡萄糖，測(cè)定破碎菌體上清中的酶活及菌體干重，結(jié)果如圖7，隨著葡萄糖濃度的上升，菌體干重趨于穩(wěn)定，可能是菌體生長(zhǎng)受到溶解氧濃度的限制，胞內(nèi)酶活隨著葡萄糖濃度上升而下降，過(guò)快的生長(zhǎng)速度導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。培養(yǎng)基添加30～40 g/L的葡萄糖，一定程度上促進(jìn)菌體生長(zhǎng)及酶的表達(dá)，刪去啟動(dòng)子PamyQ’的cre位點(diǎn)可減少碳源代謝產(chǎn)物對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制，促進(jìn)外源基因表達(dá)。

圖7 高濃度葡萄糖對(duì)改造后重組菌WB2生長(zhǎng)及FAD-GDH表達(dá)的影響Fig.7 FAD-GDH expression and cell growth of recombinant WB2 with more glucose

3 結(jié)論

構(gòu)建含有單啟動(dòng)子PHpaⅡ的重組質(zhì)粒pMA5-1，轉(zhuǎn)入B.subtilis，測(cè)定酶活及飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定表明重組菌表達(dá)了具有活性的FAD-GDH。分別選取2種組成型啟動(dòng)子(PHpaⅡ-PamyQ’，PHpaⅡ-P43)和兩種鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PHpaⅡ-PgsiB，PHpaⅡ-Popuaa)串聯(lián)成雙啟動(dòng)子分別表達(dá)FAD-GDH，含組成型雙啟動(dòng)子PHpaⅡ-PamyQ’的重組B.subtilis，胞內(nèi)表達(dá)量最高為2 497 U/L，PHpaⅡ-PamyQ’雙啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度增加可能是由于轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度增加。本實(shí)驗(yàn)中采用的其他雙啟動(dòng)子表達(dá)FAD-GDH的活性低于單啟動(dòng)子，可能是啟動(dòng)子之間的排列順序會(huì)影響啟動(dòng)之間的相互作用，靠近異源基因的啟動(dòng)子可能會(huì)更大程度地影響外源基因的表達(dá)[28]。在PHapII與gdh基因之間插入不同的啟動(dòng)子后，其RBS也被隨之替換為新插入啟動(dòng)子的RBS，因此酶活性的變化也很有可能是由于翻譯強(qiáng)度的變化引起的。

發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)葡萄糖和甘油會(huì)抑制串聯(lián)啟動(dòng)子PamyQ’突變株的發(fā)酵產(chǎn)酶，存在碳代謝產(chǎn)物抑制效應(yīng)。為了減少發(fā)酵中的碳代謝抑制，采取刪去PamyQ’啟動(dòng)子中與碳代謝阻遏因子結(jié)合的cre位點(diǎn)，構(gòu)建的含有缺失cre位點(diǎn)的雙啟動(dòng)子PHpaⅡ-PamyQ2重組B.subtilis，使FAD-GDH酶活從2 497 U/L提高到3 626 U/L， 說(shuō)明啟動(dòng)子PamyQ’中cre位點(diǎn)的刪除有效地減少了碳源代謝產(chǎn)物對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制，促進(jìn)外源基因表達(dá)。