來源于Wenyingzhuangia屬海洋細菌的一種β-瓊膠酶的克隆表達及性質研究

田雪健，申晶晶，常耀光

(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003)

瓊膠是一種紅藻來源的海洋多糖[1]，因其膠凝性及凝膠穩定性，目前被廣泛應用于食品、生物工程、醫藥等行業[2]。瓊膠的主要組分為瓊脂糖，結構由(1-3)-O-β-D-吡喃半乳糖殘基(G殘基)及(1-4)-O-3,6-內醚-α-L-吡喃半乳糖殘基(LA殘基)交替組成[3]。由瓊膠降解得到的瓊膠寡糖已被證實具有多種生理調節功能，如抑菌性[4]、抗氧化性[5]、抗病毒[6]等，在功能食品開發方面展現出巨大的應用潛力。

瓊膠酶是一類可特異性降解瓊膠中的瓊脂糖組分生成瓊膠寡糖的水解酶，根據水解位置的差異，瓊膠酶分為識別α-1,3糖苷鍵的α-瓊膠酶及識別β-1,4糖苷鍵的β-瓊膠酶[7]。根據氨基酸序列，目前發現的β-瓊膠酶分屬于4個糖苷水解酶(glycoside hydrolyase，GH)家族，即GH16、GH50、GH86及GH118家族，其中GH16家族β-瓊膠糖因具有良好的酶學性質及高催化效率受到廣泛關注[8]。

本研究擬以微生物基因組出發，以生物信息學及分子生物學的手段獲取新型瓊膠酶。實驗室前期分離到1株海洋細菌WenyingzhuangiafucanilyticaCZ1127T[9-10]，并完成了該細菌的全基因組測序，初步的生物信息學分析表明，該細菌的基因組中含有多條GH16家族糖苷水解酶基因，并在其中發現了1條潛在的β-瓊膠酶基因aga16A(WP_068828902.1)。本研究擬對該序列進行生物信息學分析、分子克隆及異源表達，進一步考察其編碼蛋白Aga16A_Wf的酶學性質、動力學常數、作用方式及降解產物，以期為瓊膠寡糖的制備及后續研究與應用尋找新工具。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海洋細菌WenyingzhuangiafucanilyticaCZ1127T，實驗室篩選并保存； TLC 硅膠60F254薄層色譜板，默克生命科學技術；瓊膠底物(REGULAR AGAROSE G-10)，BIOWEST；磁珠法基因組DNA抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；切膠回收試劑盒，OMEGA；高純質粒小量快速提取試劑盒(離心柱型)、BL21(DE3)感受態細胞，北京博邁德基因技術有限公司；pET-28a(+)質粒，安諾倫(北京)生物科技；限制性內切酶BamHI/XhoI，賽默飛世爾科技；HiPrepTM26/10 Desalting、HisTrapTMHP、Superdex peptide 10/300 GL色譜柱，GE生命科學；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)，碧云天生物技術；預染蛋白分子量標準，賽默飛世爾科技；其他化學試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學分析

利用dbCAN[11]及SignalP 4.1[12]等軟件對蛋白序列Aga16A_Wf可能存在的蛋白結構域進行預測，采用ExPASy[13]對蛋白的理論分子質量進行預測，使用BLASTP[14]、ClustalX2[15]與MEGA6[16]對Aga16A_Wf與已知GH16家族β-瓊膠酶序列的相似度及進化關系進行分析。

1.2.2 Aga16A_Wf的克隆表達

將W.fucanilyticaCZ1127T接種于2216E液體培養基中，收集菌體并提取基因組DNA。利用PCR對去除信號肽后的目的基因進行擴增，并在序列的N端添加6×His標簽。上下游引物序列分別為5’-GACACGGATCCGCAAGTGATTCGGTAGCCA-3’、5’-GACACCTCGAGTTATTTACTTTTTAACTTCC-3’。使用限制性內切酶BamH I/XhoI對PCR擴增產物及pET-28a(+)載體進行酶切，并將處理后的目的片段和載體連接。將構建好的表達載體轉化至BL21(DE3)感受態細胞中。將轉化的大腸桿菌接種于含30 ng/μL卡那霉素的LB培養基中，并于37 ℃、180 r/min 培養，至菌液OD600值達到0.4時，添加終濃度為0.5 mmol/L 的異丙基β-d-硫代半乳糖苷，之后17 ℃誘導培養18 h。

1.2.3 酶的分離純化及純度檢測

收集誘導培養后的菌體，以20 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0)重懸，超聲破碎后離心獲取上清液。以HisTrapTMHP色譜柱對上清液中的目標蛋白進行親和層析純化，平衡流動相為含0.3 mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉(pH 7.0)，洗脫梯度為0～0.5 mol/L咪唑。收集酶活組分，并以HiPrepTM26/10 Desalting色譜柱脫鹽，流動相為20 mmol/L 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0)。純化后蛋白的純度及分子量通過SDS-PAGE進行分析，分離膠質量濃度為120 g/L，染色劑為考馬斯亮藍R-250。

1.2.4 β-瓊膠酶酶活測定

除特殊說明外，酶活測定體系均為：750 μL 2 mg/mL 底物溶液(20 mmol/L pH 7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液溶解，含0.1 mol/L NaCl)與750 μL適當稀釋的酶液混合，50 ℃反應10 min后于100 ℃金屬浴處理5 min以滅活。采用pHBH法[17-18]表征酶解反應前后還原糖增量，以D-半乳糖作為標準品。酶活單位(1 U)定義為酶液1 min內水解底物產生1 μmol 還原糖的活力。蛋白濃度由BCA試劑盒測定。

1.2.5 酶學性質研究

1.2.5.1 溫度對Aga16A_Wf的影響

將底物與酶混合后置于15～70 ℃下反應10 min，檢測Aga16A_Wf在不同溫度下的酶活。將酶液分別于4、25、40、50 ℃放置24 h，間隔一定時間取樣測定酶活，以放置0 h時的酶活力為100%，計算Aga16A_Wf在不同溫度下的酶活殘余率(%)。

1.2.5.2 pH對Aga16A_Wf的影響

以不同pH值的緩沖液溶解底物或置換酶液中的溶劑(pH 4.0～7.0：20 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；pH 6.5～9.0：20 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液；pH 9.0～11.0：20 mmol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液)，將對應pH值的酶與底物混合，測定不同pH值下酶的活力。以不同pH值的緩沖液置換酶液中的溶劑，將酶液于4 ℃放置1 h后，將pH值調至7.0并測定酶活，將未經任何處理的酶液的活力定義為100%，計算酶液在不同pH下的酶活殘余率(%)。

1.2.5.3 金屬離子及化學試劑對Aga16A_Wf的影響

配制不同NaCl質量濃度的2 g/L瓊膠底物，使反應體系中的NaCl濃度為0～1 mol/L，考察Na+濃度對酶活的影響。向反應體系中分別添加金屬離子K+、Mg2+、Zn2+、Cd2+、Ca2+、Mn2+、Hg2+及化學試劑EDTA-2Na、SDS與β-巰基乙醇，使其終濃度為1 mmol/L， 將未添加金屬離子的酶活力定義為100%，計算酶活比率(%)。

1.2.5.4 動力學常數的測定

將酶液與不同質量濃度的瓊膠溶液混合(反應體系中的底物質量濃度為0.01～0.20 g/L)，測定不同底物濃度下的酶活。依據Michaelis-Menten方程，計算Aga16A_Wf的動力學常數Km、Kcat。

1.2.6 作用方式研究

將1 U Aga16A_Wf加入至50 mL 2 g/L瓊膠底物溶液(20 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解)，25 ℃ 反應至24 h，間隔取樣后100 ℃滅活5 min，取15 μL以薄層色譜(TLC)對寡糖成分進行分析。TLC展開劑組分的體積比為V(正丁醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)=2∶1∶1，顯色劑為含體積分數10%硫酸的乙醇。

為制備降解終產物，取1、30、50、100 U的Aga16A_Wf分別與50 mL質量濃度2 g/L瓊膠進行反應，25 ℃酶解24 h后以TLC分析寡糖組成。

使用Superdex peptide 10/300 GL色譜柱對上述1 U Aga16A_Wf酶解24 h產物進行分離，收集各寡糖組分凍干后加入體積分數25%乙腈(含50 mmol/L甲酸銨)復溶，以質譜儀進行分析。質譜分析的流動相為體積分數25%乙腈(含50 mmol/L甲酸銨)，離子源為負離子模式，源溫為300 ℃，毛細管電壓為4 000 V，分子質量掃描范圍為100～2 000 u。

1.2.7 數據統計

各實驗重復3次，結果以平均值±標準偏差表示。顯著性差異以SPSS 16.0軟件進行分析，采用Duncan’s ANOVA檢測，以P<0.05作為顯著性差異的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 Aga16A_Wf的生物信息學分析

Aga16A_Wf由324個氨基酸組成，SignalP 4.1與dbCAN預測該序列包含1段C端信號肽及1個GH16家族結構域(如圖1所示)。

利用BLASTP程序對Aga16A_Wf以及GH16家族的已知蛋白序列進行局部比對，發現Aga16A_Wf與CatenovulumagarivoransYM01產β-瓊膠酶相似度最高，但僅為66%(覆蓋率為85%)，表明Aga16A_Wf是1個較為新穎的酶。

圖1 Aga16A_Wf結構域分布Fig.1 Domain structure of Aga16A_Wf

GH16家族除β-瓊膠酶外，還包括κ-卡拉膠酶、β-紫菜多糖酶、地衣多糖酶及海帶多糖酶等多種糖苷水解酶。Aga16A_Wf與已知GH16家族β-瓊膠酶序列構建的系統發育樹如圖2所示，結果表明Aga16A_Wf處于β-瓊膠酶的系統發育樹中，預示該序列具有GH16家族β-瓊膠酶活力。

圖2 Aga16A_Wf與已知GH16家族β-瓊膠酶構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Aga16A_Wf and all characterized GH16 β-agarase sequences注：星號標識為Aga16A_Wf，三角形標識為晶體結構已知的GH16家族β-瓊膠酶；各序列信息按照GenBank收錄號、蛋白名稱及菌種來源依次標注。

將Aga16A_Wf與具有明確晶體結構的GH16家族β-瓊膠酶序列進行多序列比對，結果如圖3。據報道，AgaA_Zg的關鍵催化位點包括E147及E152[19]，其中E147為催化親和位點，E152為質子供體，上述關鍵催化位點在目前得到酶活確認的GH16家族β-瓊 膠酶序列中均嚴格保守。Aga16A_Wf在上述2個位點與比對序列表現出一致性(圖3)，進一步提示該酶具有潛在的β-瓊膠酶活力。

圖3 Aga16A_Wf序列比對結果Fig.3 Multiple sequence alignment of Aga16A_Wf注：星號標注的位點為GH16家族β-瓊膠酶的關鍵催化位點。

2.2 Aga16A_Wf的克隆表達及功能驗證

將超聲破碎后的胞內上清酶液，使用親和層析進行分離純化，0.25 mol/L咪唑洗脫組分表現出β-瓊膠酶活力。純化后酶的活力為23.67 U/mg，酶活回收率為57%。SDS-PAGE分析結果顯示，純化后酶蛋白為單一條帶，表明其純度良好。根據SDS-PAGE，重組表達的Aga16A_Wf的分子質量約為40 ku，與預測分子質量(38.1 ku)吻合。上述結果證實Aga16A_Wf為β-瓊膠酶，aga16A為β-瓊膠酶基因(圖4)。

M-預染蛋白分子質量標準圖4 純化后Aga16A_Wf的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE of purified Aga16A_Wf

2.3 Aga16A_Wf酶學性質研究

2.3.1 溫度對酶活的影響

不同的反應溫度對Aga16A_Wf酶活的影響如圖5-A所示，該酶的最適反應溫度為50 ℃。瓊膠具有凝膠性，Aga16A_Wf的最適反應溫度高于瓊膠的凝膠溫度(約40 ℃)[20-21]，在此溫度(50 ℃)下，瓊膠可保持溶液狀態，因此酶解反應將在均相條件下進行，從而保證了反應效率，有利于寡糖的高效制備。此外，Aga16A_Wf在較低溫度下也表現出較高活力，15 ℃ 及20 ℃時的活力分別為最適溫度時的68.1%與69.9%，說明此酶具有適冷性。

Aga16A_Wf的熱穩定性情況如圖5-B。該酶在25 ℃下放置24 h，酶活殘余率為80%；此外，在不加任何保護劑的情況下，Aga16A_Wf在4 ℃時酶活基本保持不變，且至少可穩定保存15 d。然而，該酶在高溫下的穩定性較差，50 ℃放置5 h酶活僅剩22%，這一現象與多數海洋來源的酶類似[22-24]。

盡管Aga16A_Wf的酶活在最適反應條件下損失較快，但本研究證實1U該酶在50 ℃下酶解5 mL體積分數為2%瓊膠溶液，15 min內即可使瓊膠失去凝膠能力，之后轉為低溫或室溫下反應，借助該酶的適冷性，酶解反應的速率仍較高，并可減少反應的熱能消耗。

2.3.2 pH對酶活的影響

反應體系pH值對Aga16A_Wf酶活的影響如圖5-C所示，結果表明該酶的最適反應pH值為7.0，并在pH 6～8展現出較高活力，偏中性的最適反應pH值與大多數已報道的GH16家族β-瓊膠酶相似[25-28]。Aga16A_Wf的pH值穩定性如圖5-D，Aga16A_Wf在pH 6.5～9.0下基本能保持穩定(酶活殘余率>80%)。

2.3.3 NaCl、金屬離子及化學試劑穩定性

NaCl對Aga16A_Wf酶活的影響如圖6。Aga16A_Wf在未添加NaCl的反應體系中可展現出活力；但相較NaCl添加量為0的反應體系，0.05 mol/L NaCl可使Aga16A_Wf的酶活提高2.5倍。NaCl顯著促進酶活的現象與多種海洋細菌來源的β-瓊膠酶相一致[23, 29-30]，NaCl可能通過改變底物的物理狀態或構象從而影響酶活[31-32]。

如表1所示，Ca2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+、Cd2+及SDS對酶活無顯著影響；EDTA-2Na與Hg2+顯著降低了酶活，可能由于EDTA-2Na與催化相關的金屬離子螯合從而影響了活力，Hg2+可能破壞催化中心

A-最適反應溫度；B-溫度穩定性；C-最適反應pH值； D-pH值穩定性圖5 Aga16A_Wf酶學性質Fig.5 Biochemical characteristics of Aga16A_Wf

圖6 NaCl對酶活的影響Fig.6 The influence of NaCl on Enzyme Activity

的巰基從而使活性顯著降低；K+顯著提高了酶活，此現象與NaCl對酶活的影響結果相類似，說明一價金屬陽離子可增加酶解效率。

表1 金屬離子和化學試劑對Aga16A_Wf酶活的影響Table 1 Effect of metal ions and chemicalson the activity of Aga16A_Wf

2.3.4 動力學常數

以0.01～0.20 g/L的瓊膠為底物，反應體系溶液環境為20 mmol/L pH 7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(含0.05 mol/L NaCl)，50 ℃下測定Aga16A_Wf的酶促動力學常數，測得Km為3.6 g/L，Kcat為287.88 s-1。

2.4 作用方式研究

1 U Aga16A_Wf酶解50 mL、2 g/L的底物5 min 后，即檢測到不同聚合度寡糖的生成(圖7-A)，證明Aga16A_Wf為內切型降解酶；隨著反應時間的延長，高聚合度的寡糖明顯減少，2 h后延長反應時間未見寡糖組成明顯變化(圖7-A)。隨加酶量的增大(1～100 U)，組分Ⅱ不斷減少而組分I逐漸增多，始終未檢測到較組分Ⅰ更小的降解產物出現(圖7-B)，表明Aga16A_Wf的最小作用底物為組分Ⅱ，最小產物為組分Ⅰ。

A-不同反應時間酶解產物；B-不同加酶量酶解產物圖7 Aga16A_Wf酶解產物的TLC分析Fig.7 TLC analysis of the hydrolysis products of Aga16A_Wf

為進一步確認降解產物的化學組成，利用電噴霧質譜技術對組分Ⅰ與組分Ⅱ進行鑒定。如圖8-A，組分Ⅰ的分子離子峰[M-H]-的質荷比為323，表明其為二糖LA-G(324 u)；如圖8-B，組分Ⅱ的分子離子峰[M-H]-的質荷比為629，表明其為四糖[LA-G]2(630 u)。綜合TLC與質譜鑒定的結果，Aga16A_Wf的最小作用底物為四糖，最小產物為二糖。

A-組分Ⅰ；B-組分Ⅱ圖8 組分Ⅰ及組分Ⅱ的質譜鑒定結果Fig.8 The mass spectra of fractions Ⅰ and Ⅱ generated by Aga16A_Wf

3 結論

本研究從海洋細菌W.fucanilyticaCZ1127T的基因組出發，運用生物信息學方法尋找到1個新穎的GH16家族β-瓊膠酶Aga16A_Wf，成功在大腸桿菌中實現其外源表達，并系統研究了其酶學性質、動力學參數及作用方式。Aga16A_Wf的最適反應溫度為50 ℃ 且展現出適冷性，最適pH為7.0，在pH 6.5～9.0及室溫以下的環境中具有較好的穩定性。其動力學常數Km為3.6 g/L，Kcat為287.88 s-1；該酶以內切形式降解瓊脂糖，最小作用底物為四糖，最小產物為二糖。Aga16A_Wf具有最適反應溫度高、適冷性、內切型降解的特點，可作為高效制備瓊膠寡糖的工具。