屎腸球菌Enterococcus faecium R2的分離鑒定及其在酸漿豆干加工中的應用

陳志娜，葉韜，丁曼，尹琳琳，黃琳，夏悅，裴紀柳

(淮南師范學院 生物工程學院，安徽 淮南，232038)

黃漿水是豆腐加工過程中產生的副產物，在豆腐加工過程中需加入10倍左右的水來將大豆研磨成漿，其中約有1/2～1/3的水在后續的加工過程中被瀝出[1]。黃漿水中含有大豆異黃酮、蛋白質和VP、VK等營養物質，以及大量水溶性的糖類如水蘇糖、棉籽糖等低聚糖，非常適宜微生物的生長[2]，生產過程中直接排放不僅造成資源的浪費，而且會對周圍的環境造成嚴重的污染。我國民間有利用黃漿水在自然條件下發酵產酸獲得酸漿凝固劑，制得酸漿豆腐[3]。與石膏、鹵水作為凝固劑的豆腐相比，酸漿豆腐具有質地細膩、保水性好、口感鮮嫩等特點，深受人們的喜愛。但是自然發酵條件下制備的酸漿，微生物菌群復雜，除了產酸的乳酸菌外，還可能污染致病菌和雜菌[4]，造成酸漿質量不穩定，并對豆腐的安全性構成危害。而一些商用乳酸菌如干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌在發酵利用黃漿水時需要前期補充蔗糖、葡萄糖等營養素或者在發酵結束后補充醋酸才能達到合適的酸度[5-6]，增加了生產成本。因此，篩選出可以高效利用黃漿水的優質菌種對于黃漿水的開發利用及酸漿豆腐的規范化生產具有重要意義。

本研究采用平板涂布法從泡菜中分離乳酸菌，再將其轉接至黃漿水培養基以pH值及生物量為指標篩選產酸能力最強的菌株，對其進行生理生化及分子生物鑒定，并用該菌種對黃漿水進行純種發酵制備酸漿豆干，以發酵特性和感官評定為指標對其品質進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級黃豆：淮南市蘇果超市；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；16S rDNA細菌鑒定PCR試劑盒：大連寶生物有限公司。

MRS培養基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，葡萄糖 20 g，牛肉膏10 g，無水乙酸鈉5 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，瓊脂粉 20 g，CaCO320 g，吐溫-80 1 mL。

黃漿水培養基：黃漿水121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

1.2 儀器與設備

ABI型PCR儀，美國ABI公司；pHS-3C pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；TA-XTPLUS物性測試儀，英國STABLE公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；GEL DOC XR凝膠成像系統，美國Bio-rad；SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LRH-250-A生化培養箱，廣東泰宏君科學儀器股份有限公司；5804R型離心機，Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

取泡菜樣品10 g，置于90 mL無菌生理鹽水中，均勻混合后用無菌生理鹽水進行梯度稀釋至10-3、10-4、10-5，取各稀釋度樣品200 μL均勻涂布于MRS分離培養基上，37 ℃靜置培養48 h。挑取溶鈣圈較大、培養基變黃的菌落，用平板劃線法在MRS固體培養基上劃線分離，如此重復直至分離純化得到形態一致的、純的單菌落，進行革蘭氏染色和接觸酶實驗，淘汰非目標菌，目標菌采用25%的甘油保存待用。

1.3.2 乳酸菌的篩選

將純化后的目標菌株分別轉接到滅菌后的黃漿水培養基中，于37 ℃下靜置培養72 h，以乳酸菌生物量和發酵液pH值為指標評價乳酸菌的發酵性能，篩選出1株生物量最高、pH值最低的乳酸菌菌株R2。

1.3.3 菌株鑒定

(1) 生理生化實驗：參照《伯杰細菌鑒定手冊》對菌株R2進行耐酸性試驗、耐鹽性試驗和糖發酵試驗等生理生化試驗[7]。

(2)分子生物學鑒定：將菌株R2接種到MRS培養基中，37 ℃下靜置培養16 h，離心收集沉淀，按照細菌基因組DNA快速抽提試劑盒方法提取菌株R2總DNA。將提取的DNA模板進行PCR擴增，采用正向引物：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1 492R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應體系(25 μL)：模板DNA 1 μL，正、反向引物 1 μL， Mix 12.5 μL，超純水補足至25 μL。PCR反應條件為：預變性94 ℃ 5 min；變性 94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s； 延伸72 ℃ 1.5 min，共30個循環，最后72 ℃延伸5 min。 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢驗后送通用生物系統(安徽)有限公司進行測序。所得序列通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行序列相關性分析，提交到GenBank獲得序列號，采用MEGA 4.0軟件、以Neighbor-joining法構建系統發育樹。

1.3.4 藥敏性測定

選用四環素、萬古霉素、青霉素、鏈霉素4種藥物對屎腸球菌E.faeciumR2作藥敏試驗。采用Kirby-Bauer擴散法，將1.0 mL菌懸液(106～107CFU/mL)與15 mL含1.5%瓊脂的MRS培養基混合后傾倒平板，待平板凝固后按照說明書要求貼放藥敏紙片，于37 ℃恒溫培養18～24 h后測量抑菌圈直徑，參照美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)執行標準進行藥敏性判斷[7]。

1.3.5 純種發酵酸漿的制作

以傳統工藝制作的鹵片黃漿水作為初級黃漿水，初級黃漿水接種屎腸球菌發酵劑(接種量3%)發酵36 h制得一代酸漿。以一代酸漿做為凝固劑制得二級豆腐黃漿水，再接種屎腸球菌發酵劑(接種量3%)發酵36 h制得二代酸漿。以二代酸漿做凝固劑制得三級豆腐黃漿水，實驗以三級豆腐黃漿水為發酵基質制備酸漿與酸漿豆干，取消原鹵鹽凝固劑的影響[8]。

1.3.6 酸漿豆干的制作

取700 g食品級黃豆用蒸餾水于25 ℃下浸泡8 h， 豆水比1∶8(g∶mL)打漿，采用100目尼龍篩布過濾除渣，生豆漿煮沸并維持5 min，當降溫至85 ℃時，輕輕攪動下徐徐加入酸漿，直至出現均勻腦花，添加量為16%(質量分數)左右。85 ℃下蹲腦20 min后，將豆花倒入豆腐模具中于5.5～6.0 kPa下壓漿30 min成型，收集黃漿水，所得豆干切成小塊[9]。

1.3.7 pH值測定

采用pH計測定純種發酵和自然發酵過程中酸漿pH的變化規律。

1.3.8 微生物檢驗

參照GB/T 4789.35—2016和GB/T4789.3—2010方法測定純種發酵酸漿和自然發酵酸漿中的乳酸菌含量和大腸菌群MPN。

1.3.9 感官評定

參照張影等[8]的方法及GB/T 22106—2008中 6.1的感官要求，略有修改。選取食品專業的10名同學組成感官評定小組，由小組討論確定描述性感官指標術語和評分標準，然后將酸漿豆干樣品按3位數編號后隨機發放給評審員，參照表1對樣品的感官屬性進行打分(0～10分)。

表1 酸漿豆干感官評定標準Table 1 Sensory attributes of acid slurry dried bean curds and their definitions

續表1

指標評分標準評分/分口感細膩爽滑、彈性好、無酸味、不黏牙8～10口感口感較爽滑、彈性一般、少許酸味5～7粗糙或成漿糊狀、無彈性、有異味0～4斷面整齊、表面光滑8～10斷面結構斷面較整齊、表面較光滑5～7斷面不整齊、表面粗糙0～4

1.4 數據統計與處理

結果以平均值±標準差表示，使用SPSS 18.0軟件對結果進行統計分析(One-way ANOVA)，用OriginPro 8.0 和Excel 2007軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離篩選

從泡菜樣品中分離到4株溶鈣圈較大的菌落，對其進行純培養，革蘭氏染色后顯微鏡觀察菌體形態，確定為單菌落后將其分別轉接至黃漿水培養基中，培養36 h后，測定生物量及發酵液pH值，結果如圖1所示。

圖1 四株乳酸菌對黃漿水的發酵性能的影響Fig.1 Fermentation performance of four strains of lactic acid bacteria on bean curd water

由圖1可以看出，所選4株菌株對黃漿水的發酵性能的影響差別很大，其中菌株R2的發酵性能最強，在發酵36 h后，黃漿水的pH值下降到3.5左右，同時其菌體量OD600也達到2.0以上。一般當酸漿的pH值達到3.8～4.0時即可作為豆腐凝固劑[5]，因此，菌株R2可以在無需補充蔗糖葡萄糖等營養素的前提下，直接利用黃漿水中的低聚糖發酵產酸，且在發酵結束后無需補充醋酸即可達到適宜的酸度。

2.2 菌株R2的鑒定

菌株R2菌落成圓形，乳白色、不透明、表面光滑濕潤、凸起、邊緣整齊、直徑1 mm左右圓形菌落；油鏡下觀察其菌體呈橢圓形或圓形、無芽孢、成對成鏈或聚團排列(圖2)。

圖2菌株R2的菌落形態和菌體形態Fig.2 The colonial morphology and the shape of strain R2

菌株R2的生理生化鑒定結果詳見表2。由表2可知，菌株R2可在pH 11.0、6.5%(質量分數)NaCl和40%(質量分數)膽汁環境中生長，不能分解可溶性淀粉、山梨醇，可以分解乳糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖等，根據《伯杰細菌鑒定手冊》和《乳酸菌的分類鑒定》，菌株R2的情況基本符合屎腸球菌的生理生化特征。

表2 屎腸球菌R2生理生化特征Table 2 Physiologial and biochemical characterization of strain R2

注：“+”實驗結果為陽性；“-”試驗結果為陰性。

進一步經PCR擴增和序列測定，獲得菌株R2的16S rDNA序列片段，GenBank登錄號為MG456825。進一步經過BLAST在線比對，與E.faecium(KY490552)的相似性達到99%，并利用MEGA 4.0軟件與相近種構建系統發育樹，如圖3所示，確定菌種為屎腸球菌，命名為E.faeciumR2。該菌種現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.14944。

圖3基于菌株R2 16S rDNA序列建立的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain R2

2.3 屎腸球菌R2對常見抗生素的敏感性

屎腸球菌屬于乳酸菌的一種，是腸道內的正常菌群，廣泛存在于傳統乳制品[10]、泡菜[11]、豆醬[12]等發酵食品中，具有耐酸、耐熱、腸道黏附能力強等特點，以及抑制病原菌、增強免疫力等作用[13-14]。但是近年來隨著抗生素的廣泛使用，屎腸球菌不斷出現耐藥性的現象，特別是對萬古霉素的耐藥性為臨床治療帶來了很大的困難[15]。因此，對擬用于食品加工菌株的耐藥性進行分析是十分必要的。由表3可看出，屎腸球菌R2對青霉素、萬古霉素等4種常見的抗生素敏感，具有潛在的安全性。

表3 屎腸球菌R2藥敏性圖譜Table 3 Antibiatic resistant profile of E. faecium R2

注：藥敏性判斷結果參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)執行標準；S：敏感；I：中介；R：耐藥。

2.4 純種發酵酸漿與自然發酵酸漿的pH變化規律

純種發酵和自然發酵酸漿的pH變化規律如圖4所示，由圖4可以看出E.faeciumR2純種發酵酸漿的pH變化趨勢與自然發酵酸漿的pH變化趨勢基本一致，發酵速度稍有滯后，發酵前24 h階段pH的下降速度較快，隨后速度變慢。發酵30 h后兩者的pH值達到4.0以下，隨后進一步降到3.6以下并保持穩定。這一結果與趙貴麗等[16]的研究結果一致，其研究發現當發酵時間達到24 h后，pH下降變緩，在48 h后達到最低值3.6左右。

圖4 純種發酵和自然發酵酸漿的pH變化趨勢Fig.4 Variation trend of pH of E. faecium R2 fermental acid pulp and natural fermental acid pulp

2.5 微生物檢測

純種發酵和自然發酵酸漿的乳酸菌菌落總數見圖5，大腸菌群MPN見表4。由圖5和表4可以看出純種發酵酸漿中的乳酸菌含量明顯高于自然發酵酸漿中的乳酸菌含量，同時純種發酵酸漿中未檢出大腸菌群。

圖5 純種發酵和自然發酵酸漿中的乳酸菌菌落總數Fig.5 Total lactobacillus colonies of E. faecium R2 fermental acid pulp and natural fermental acid pulp

杜欣等[17]研究發現在黃漿水中添加5%蔗糖后，不僅可以增強乳酸菌發酵黃漿水的能力，同時還提高了其抑菌效果。很多研究已經表明屎腸球菌具有良好的抑菌效果[18-20]，其主要的抑菌活性物質除細菌素外還有乳酸等有機酸[21]。因此，采用E.faeciumR2純種發酵制備酸漿可以有效地抑制雜菌污染，提高酸漿的安全性。

表4 自然發酵和純種發酵酸漿中大腸菌群MPNTable 4 MPN value of the coliform bacteria of E. faecium R2 fermental acid pulp and natural fermental acid pulp

2.6 感官評定

圖6為純種發酵酸漿豆干與自然發酵酸漿豆干感官特性玫瑰圖。

圖6 純種發酵和自然發酵酸漿豆干感官特性的玫瑰圖Fig.6 The seneory characteristics of acid slurry dried bean curds made from E. faecium R2 fermental acid pulp and natural fermental acid pulp

由圖6可知，純種發酵酸漿豆干與自然發酵酸漿豆干的感官特性沒有顯著區別，2種酸漿制出的豆干色澤均呈現淡黃色，組織結構完整，質地細膩，彈性好，耐咀嚼，不易碎，表面不黏，斷面較整齊表面光滑，無豆腥味無明顯酸味。說明E.faeciumR2純種發酵酸漿豆干具有傳統自然發酵酸漿豆干的色香味等感官品質。

3 結論

從泡菜中優選出1株可以直接利用黃漿水中的低聚糖發酵產酸的菌株R2，通過菌落形態、生理生化試驗及分子生物學鑒定確定菌株R2為屎腸球菌，命名為E.faeciumR2。該菌株可在無碳源添加前提下，發酵36 h后可使酸漿pH值達到3.6以下。E.faeciumR2純種發酵酸漿的乳酸菌數明顯高于自然發酵酸漿，且無大腸桿菌檢出，安全性更高。另外，E.faeciumR2純種發酵酸漿豆干的感官特性與自然發酵酸漿豆干無明顯差異。

與現已報道的純種發酵黃漿水產酸漿的乳酸菌相比，E.faeciumR2培養條件更簡單，產酸速度較快。利用該菌株進行酸漿豆腐及豆干等的生產，可以有效地生產乳酸菌等益生菌，減少污染致病菌及雜菌含量，保證酸漿的質量及穩定性，進而提高豆制品的安全性。在E.faeciumR2發酵的過程中，無需補充蔗糖、葡萄糖等碳源，且在發酵結束后無需補充醋酸即可達到適宜的酸度，有效地降低了生產成本。因此，E.faeciumR2作為一種酸漿純種發酵劑會有較為廣泛的應用前景。