多組學技術聯用在傳統發酵乳品風味代謝調控中的應用研究進展

周鉞，李鍵，張玉，王洪偉，趙欣，劉士健，索化夷*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都，610041) 3(重慶第二師范學院，重慶市功能性食品協同創新中心，重慶，400067)

發酵乳品源于我國游牧民族，多以牛羊駝馬等動物乳為原料，涉及多種微生物共棲生長，發酵形成獨特的風味品質和功能成分，同時延長乳品的保質期[1]。區別于現代發酵方式，傳統發酵沒有固定的發酵“起子”，發酵過程更加復雜多樣。表1歸納了不同類型的傳統發酵乳品及發酵優勢菌種[2-3]，發酵乳品中微生物群落存在個體代謝和復雜的相互作用，微生態的多樣性和行為差異無法保證最終發酵產品的品質穩定和安全[4]。為了闡明傳統發酵乳品風味品質的形成機理，對其實現定向調控，勢必要解析多菌種相互作用與風味代謝通路間的相關性。

當前，多組學技術聯用可以涵蓋環境所有微生物的基因表達、蛋白或代謝物差異的多層面分析，快速獲取海量數據。利用多組學聯合揭示傳統發酵乳品特征風味物質的形成機理，并以此為導向篩選功能微生物，從而對發酵生產進行指導[5]。我國傳統發酵乳品的種類豐富，大量的菌種資源有待挖掘。本文總結了近年來多組學技術在解析傳統發酵乳品特征風味成分的形成機理及其代謝調控的研究進展，并對此領域的應用前景進行展望(表1)。

表1 傳統發酵乳制品類型及主要發酵劑Table 1 The type of traditional fermented dairy products and main starter

1 多組學技術在傳統發酵食品的應用現狀

近年來，微生態多樣性的鑒定由單菌落傳統分離培養法及其核酸片段的PCR-DGGE電泳圖譜向高通量測序技術轉變[6]。基于高通量測序的宏基因組學以環境中所有微生物的基因組為研究對象，分析菌群多樣性并對不同代謝通路的功能基因聚類。LIU等首次利用功能基因組的多位點序列分型技術，成功將保加利亞乳桿菌發酵的酸化速率、產乙醛等表型特征與其功能基因序列結合，建立了一種可快速鑒定發酵菌是否具有良好發酵性能的方法[7]。利用色譜、質譜串聯分析和光譜非靶向高精度定量的特點，使蛋白質組學和代謝組學作為表征菌落代謝產物的實時原位檢測和定量分析的有力方法，已用于檢測指導發酵乳制品中微生物和代謝物的實時變化[8-9]。

單個組學通常僅代表核酸、蛋白質或代謝物一個層面的研究結果，對于物種之間的相互作用和表型預測缺少可靠的數據支撐。多組學聯合將各個水平的物質分析“打通”，在探索生物于環境變化中細胞間的發育分化、信號傳導和互作網絡，為宿主響應環境改變做出的應激擾動、宿主內部代謝通路的調控提供有效調控靶點，是系統生物學研究發展的一大趨勢[10]。當前，多組學技術聯用作為解析傳統發酵食品“菌群-基因-代謝產物”關聯性的主要手段，從多水平剖析驗證食品微生物的組成對發酵風味品質的形成機理[11]。

2 傳統發酵乳制品主要風味成分

特征風味作為發酵食品的“骨架”，是傳統發酵食品高附加值的體現。由于每種風味成分具有不同的物性，僅憑單一的手段無法將所有風味成分完整地提取出來[12]。隨著近幾年對傳統發酵食品的風味導向調控成為研究熱點，利用代謝組學對痕量風味物質定性、定量，并結合電子鼻或嗅辨儀挖掘特征風味成分(或關鍵活性風味物質)，為進一步闡明傳統發酵食品的風味形成機理和核心微生物的代謝機制奠定了基礎[13]。本文參考徐巖等[14]對中國白酒、精油特征風味成分的挖掘，繪制了特征風味成分判定的技術路線(如圖1所示)[14-16]。

圖1 特征風味化合物判定技術路線Fig.1 Technical roadmap of key aroma-active compound determination

乳制品發酵風味取決于乳源中脂肪、蛋白和碳水化合物的相對平衡，其中乳酸、乙醛、雙乙酰、丁二酮和乙偶姻被證實對風味有很大影響。此外，在開菲爾、酸馬奶、意大利干酪等有酵母參與的發酵乳制品中，醇類物質是清香和酒香的重要貢獻者[17-18]。表2參考CHEN等總結列出了發酵乳制品中主要風味成分及特征描述[19]。

表2 發酵乳品中主要風味化合物、香氣描述及閾值Table 2 Main flavor compounds, aroma description and threshold in fermented dairy products

揮發性醛、酮等羰基類化合物的含量對發酵乳制品的香氣有顯著影響，乙醛和2,3-戊二酮的形成與蘇氨酸代謝通路有關[20-21]。揮發性醛類化合物是發酵乳中的微量香氣組分，微量的乙醛(23～40mg/kg)賦予酸乳青蘋果或堅果味，過多的醛類會帶來青草臭[22]。酮類物質多具有果香、花香和奶香味，其中雙乙酰是酸乳的特征風味物質，易被微生物的雙乙酰還原酶還原成乙偶姻。乙偶姻和雙乙酰具有相似的甜奶油香氣，但乙偶姻的風味明顯弱于雙乙酰，且在適當范圍(1.2～28.2mg/kg)可以減弱丁二酮的刺激性[23-24]。酯酶和醇酰基轉移酶的活性以及含醇量是發酵乳制品中酯類成分含量的限制因素，酯類的香氣閾值較低而對發酵乳的果味形成有很大貢獻[25]。不同濃度的酯類含量對發酵乳風味的貢獻不同，低濃度的酯類物質對整體風味的平衡有積極作用，還可以掩蓋或弱化過多的短鏈脂肪酸造成的異味或“不潔”味道[26]。

3 多組學聯用在微生物代謝與風味形成機理研究的應用

傳統發酵乳品是以乳酸菌、酵母和霉菌為主的多菌種共棲發酵，發酵風味的形成與菌群相互作用、發酵環境改變引起的代謝通路相關酶的基因表達變化有關。通過多組學聯用對微生態多樣性、基因和代謝水平的差異分析，明確與特征風味成分形成相關的微生物及其基因的轉錄表達，表征了發酵風味物質代謝調控關鍵的“生物標志”。基于傳統發酵乳制品品種多樣，制作工藝和發酵菌種地域性差異較大，其中以干酪微生物研究最多。后文以傳統發酵干酪中的微生物代謝研究為例，介紹近年組學聯合在發酵微生物和風味代謝有關基因的研究應用。

3.1 發酵優勢菌種及代謝功能基因

同所有傳統發酵食品一樣，干酪中的微生物種類隨發酵成熟而變化。利用宏基因組聯合轉錄組測序對菌群演替和相關基因表達的實時監測，取代了傳統菌落計數法無法測量死細胞和不可培養菌的弊端，明確了樣本中活細胞和死細胞的DNA分子比例，便于了解不同發酵階段的優勢菌種[27]。

研究表明，意大利干酪由Lb.casei和Lb.buchneri等非“起子”乳桿菌驅動成熟，其豐度隨成熟環境溫度的升高而增加[28]。Geotrichumcandidum和Penicilliumcamemberti等真菌是卡門培爾干酪成熟的主要貢獻菌，前者具有代謝氨苦味肽、增強干酪硫磺味的能力。功能基因注釋表征了干酪微生物含多種酪蛋白和氨基酸的分解酶系，其中P.freudenreichiisubsp.shermanii JS含有編碼絲氨酸蛋白酶HtrA和絲氨酸脫氨酶基因，以及寡肽轉運蛋白基因和參與支鏈脂肪酸形成的支鏈氨基酸氨基轉移酶基因ilve[29]。同時，P.freudenreichii含有一些胞內肽酶基因，如pepO，pepC，pepE，然而尚未闡明這些肽酶基因的存在對乳品苦味肽的降解有所貢獻[30]。

干酪內部的碳水化合物代謝以乳糖分解和檸檬酸鹽代謝為主，最終形成乙醇、乳酸和一些C4揮發性風味成分。然而很少有乳酸菌可直接利用檸檬酸鹽，利用宏基因組學可以判斷檸檬酸代謝基因的有無，或通過編碼轉錄調節因子草酰乙酸脫羧酶和檸檬酸轉運蛋白基因對其分類[31]。盡管在Lb.rhamnosus和Lb.helveticus均有編碼檸檬酸裂解酶的基因citD，citF和citE，但僅有Lb.rhamnosus擁有草酰乙酸脫羧酶基因，能夠將檸檬酸鹽降解為丙酮酸。

3.2 風味物質形成途徑與菌種代謝功能基因表達

干酪中的微生物區系及其在發酵過程的活性決定了最終的發酵風味，風味物質需要通過代謝有關基因的轉錄表達與發酵微生物建立關系。基于宏基因組、轉錄組和代謝組聯合對菌群代謝基因表達和風味物質的產生時期進行關聯分析，以揭示發酵風味的形成機理。

干酪中乳糖的分解代謝是形成C4揮發性成分的主要途徑。聯合轉錄組測序研究，發現乳糖轉運和利用的相關基因片段在成熟早期由霉菌顯著表達，未發現酵母含有乳糖代謝基因，證實G.candidum不具有乳糖分解能力。編碼乳糖特異性磷酸烯醇式丙酮酸轉運系統的基因lacEF和ptsl以及參與糖酵解和異生途徑的轉錄基因主要在Lc.lactis中高豐度表達[27]，此外，P.camemberti等真菌中的磷酸烯醇式丙酮酸激酶和果糖-1,6-二磷酸酶基因在干酪成熟早期高度表達，基于真菌代謝對干酪成熟的重要性，將磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因是否表達作為評判卡門培爾奶酪成熟過程正常與否的生物標志物[32]。干酪內部的碳水化合物代謝以乳糖分解和檸檬酸鹽代謝為主，最終形成乙醇、乳酸和一些C4揮發性風味成分。檸檬酸鹽作為乳制品的特征風味化合物雙乙酰和乙偶姻的前體物質，也可以通過微生物降解。研究發現，瑞士干酪冷藏后熟期間，Lb.rhamnosus中乳糖和檸檬酸鹽分解相關的基因下調，使得后熟風味物質雙乙酰、乙醛降低。然而，Lc.lactis的代謝基因與之相反，其L-乳酸脫氫酶基因(ldh)在后熟期間顯著上調，促使同型乳酸發酵的進行[30]。

酪蛋白和氨基酸是多種揮發性化合物的前體，前者通過幾種膜蛋白酶PrtP，PrtH和PrtR降解為肽，經寡肽，二肽和三肽蛋白轉運家族轉運進入細胞中被肽酶水解成氨基酸；后者通過轉氨基、脫氫、脫羧和C-S鍵斷裂等反應酶系分解[30]。研究發現Lc.lactis具有兩條氨基酸分解途徑，其一由氨基轉移酶bcaT和araT催化支鏈氨基酸和芳香族氨基酸形成谷氨酸。當支鏈氨基酸含量較低時，乳酸乳球菌IFPL730產生3-甲基丁醛及其還原物質3-甲基丁醇等代謝通路上的有關基因araT,bcaT,kivD,ytjE和panE的表達增加，2種物質均為切達奶酪的特征風味成分。Lc.lactis中存在另一條由β-或γ-胱硫醚裂解酶催化甲硫氨酸脫氨、脫甲硫醇反應[33]。含硫化合物的閾值低，微量即可具有強烈風味。通過宏基因組功能聚類關聯風味化合物豐度分析，表征了切達干酪成熟后期Brevibacteriumlinens、G.candidum和Staphylococcusxylosus的出現與甲硫醇及衍生物二甲硫醚的形成顯著相關[34]。

干酪熟化期間硬殼表面以碳水化合物代謝和細胞分裂代謝為主，而內部以氨基酸和脂質代謝為主。通常，脂肪分解與氨基酸代謝遵循相同的動力學，即在干酪成熟第一周顯著表達，隨后趨于緩慢穩定，產生的游離脂肪酸有利于干酪風味品質的形成。宏轉錄組數據顯示G.candidum中脂肪代謝相關酶的基因高度表達，且表達水平隨干酪成熟而提高，是干酪脂肪分解的主要貢獻菌[27]。較高的熟化溫度促進了干酪表面的乙偶姻和雙乙酰合成酶顯著表達，使得由丙酮酸合成脂肪酸代謝通路的基因表達上調，同時導致干酪內部參與脂肪酸β-氧化的基因過表達，增加干酪內部和表面的丁酸、戊酸等短鏈脂肪酸形成[28]。然而，高水平的脂肪酸帶來脂肪酸敗和乳臭味等不良感官影響，研究表明L.lactis中游離脂肪酸合成的代謝通路受長鏈酰基載體蛋白抑制物調控，避免游離脂肪酸的積累導致整體風味的失衡[35]。

4 展望

多組學技術聯用被視為微生物研究的未來，在分析菌群演替、確定功能基因、發掘活性成分的代謝網絡等具有“1+1>2”的顯著優勢。但是，國內外利用多組學技術在解析傳統發酵乳制品微生物演替或代謝機理的研究尚處于起步階段。一方面，傳統發酵乳品的制作工藝存在差異性，發酵環境具有空間異質性和動態可變性，發酵菌群不均勻分布，導致不同生長點的微生物通過不同機制的相互作用各自演化，出現多種表型，使得多組學聯用的結論缺少代表性。其次，測序平臺和質譜儀器的研發速度超過了分析軟件或數據庫的開發，導致迄今仍有海量的數據無法得到充分解析。

隨著組學檢測成本的降低，通過多組學實時監測發酵進程中微生物的動態變化、差異基因表達和代謝物的組成來構建發酵菌群預測模型，勢必成為傳統發酵食品主要的研究方向。將環境因子納入多組學的大數據分析，來預測特定環境中微生物群落的生理特性和結構演替，使多組學數據能更客觀地揭示發酵菌群的互作機制。對于獲取的多組學海量數據，配套的數據庫和多元統計分析模型的建立也需及時跟進。最后，傳統分離培養是驗證多組學數據預測微生態結構最直觀的方法，對于新基因的注釋、功能表征和物種的生理鑒定都是必要的，目前多組學數據結合傳統分離培養的結果仍是系統生物學中缺失的一環[36]。綜上，多組學聯用正在各種傳統發酵食品的研究中逐步普及，然而面對大數據如何分析挖掘、如何使結果能客觀還原傳統發酵體系，以表征傳統發酵食品的品質成熟機理是首要問題。