柱前衍生化反相高效液相色譜法測(cè)定去水衛(wèi)矛醇的含量*

王杏利，孫麗涵，張雷，吳華晶，張峻穎，吳春勇

(1.中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；2.中國(guó)藥科大學(xué)中藥制劑系，南京 211198；3.中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析系，南京 210009；4.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101)

去水衛(wèi)矛醇(dianhydrogalactitol)是以衛(wèi)矛科植物蜜花美登木中提取的衛(wèi)矛醇為原料，經(jīng)溴化、消除等反應(yīng)得到的細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物[1]，可在腫瘤組織中優(yōu)先蓄積[2]，具有毒性小的優(yōu)點(diǎn)[3]，對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病及多種腫瘤均有良好療效[4-5]。除單獨(dú)使用外，去水衛(wèi)矛醇還可與其他藥物聯(lián)合使用，并發(fā)揮協(xié)同作用[6]。去水衛(wèi)矛醇具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性，可跨血-腦屏障進(jìn)入腦部[7]，使膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖停滯在細(xì)胞周期的G2/M期，從而抑制其生長(zhǎng)[8]。作為一種潛在的多靶點(diǎn)藥物，去水衛(wèi)矛醇作為治療膠質(zhì)瘤的孤兒藥已在美國(guó)通過(guò)了Ⅱ期臨床試驗(yàn)[9]，具有較好的應(yīng)用前景。

鑒于良好的臨床應(yīng)用前景，去水衛(wèi)矛醇的新藥開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制顯得尤為重要。該品種原料[10]及制劑[11]的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)均采用滴定分析法測(cè)定含量，雖簡(jiǎn)便易行，但專屬性較差。魏寧漪等[12]采用氣相色譜(GC)法測(cè)定注射用去水衛(wèi)矛醇的含量，但筆者在重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)藥物在氣化過(guò)程中存在降解的風(fēng)險(xiǎn)。吳先富等[13]采用磁共振法測(cè)定去水衛(wèi)矛醇原料含量，但該法對(duì)儀器要求較高，應(yīng)用受到較大限制。高效液相色譜法(HPLC)具有分析速度快、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前藥品質(zhì)量控制中最常用的方法之一。去水衛(wèi)矛醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)式中缺乏生色團(tuán)，無(wú)法采用紫外檢測(cè)器測(cè)定其有關(guān)物質(zhì)和含量，因此考慮采用柱前衍生化的方法改善其紫外吸收特性。二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DDTC)是一種便宜易得的衍生化試劑，可與環(huán)氧基反應(yīng)生成穩(wěn)定的具有紫外吸收的產(chǎn)物。筆者采用DDTC作為柱前衍生化試劑，選擇使用廣泛的紫外檢測(cè)器，探索建立測(cè)定去水衛(wèi)矛醇含量的衍生化反相HPLC法，并利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)對(duì)衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 日本島津高效液相色譜儀(含二元高壓輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器及Labsolution工作站)；安捷倫6420 HPLC-MS/MS三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(含安捷倫1260 Infinity高效液相色譜儀、自動(dòng)進(jìn)樣器、電噴霧離子化接口、四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器、MassHunter數(shù)據(jù)分析處理軟件)；BT25-S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量：0.01 mg)；XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器有限公司)；HH-W三用恒溫水箱(常州市國(guó)立試驗(yàn)設(shè)備研究所)；Mini-14K微型高速離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司)；ZLS-1真空離心濃縮儀(湖南赫西儀器裝備有限公司)。

1.2試劑 去水衛(wèi)矛醇原料(批號(hào)170601)和對(duì)照品由廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司提供。乙腈(色譜純，美國(guó)天地公司)；DDTC(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為去離子純化水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Welch Ultimate XB-CN(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(50：50)，流速為1.0 mLmin-1，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子檢測(cè)模式，離子掃描范圍m/z100～500，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速9 Lmin-1，霧化氣壓力103.425 kPa，噴霧電壓4500 V。二級(jí)質(zhì)譜采用產(chǎn)物離子掃描模式，裂解電壓110 V，碰撞能20 eV。

2.3溶液的制備

2.3.1供試品溶液和對(duì)照品溶液 取去水衛(wèi)矛醇原料和對(duì)照品10 mg，精密稱定，分別置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液和對(duì)照品溶液。

2.3.2衍生化試劑溶液 精密稱取DDTC適量，加水溶解并定量稀釋制得濃度為5 %的衍生化試劑溶液。

2.3.3磷酸鹽緩沖液(pH 值7.0) 取三水合磷酸氫二鉀約0.439 g及磷酸二氫鉀0.419 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.4衍生化方法 精密量取去水衛(wèi)矛醇對(duì)照品溶液和供試品溶液各400 μL，依次精密加入磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)400 μL和衍生化試劑溶液200 μL，渦旋30 s，40 ℃水浴反應(yīng)30 min后，冰水浴5 min終止反應(yīng)。精密加入乙酸乙酯2 mL，渦旋3 min萃取衍生物，離心5 min，精密量取上清液1.8 mL，用氮?dú)獯蹈珊螅芗尤肓鲃?dòng)相800 μL復(fù)溶，進(jìn)行HPLC分析。

2.5色譜方法的建立

2.5.1色譜柱的選擇 筆者在本實(shí)驗(yàn)比較了Hypersil-CN(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Ultimate XB-CN(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Hedera ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)等不同品牌及填料的色譜柱對(duì)分析的影響，發(fā)現(xiàn)在Welch Ultimate XB-CN色譜柱上，分析物峰形對(duì)稱且保留時(shí)間合適。

2.5.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密量取去水衛(wèi)矛醇對(duì)照品溶液適量，按“2.4”項(xiàng)處理后，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成適宜濃度的溶液，于200～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描紫外吸收光譜圖(圖1)。結(jié)果表明，去水衛(wèi)矛醇衍生物在278 nm處有最大吸收。

圖1 去水衛(wèi)矛醇衍生物的紫外吸收光譜

Fig.1Ultravioletabsorptionspectrumofdianhydroga-lactitolderivative

2.5.3流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相時(shí)，基線穩(wěn)定且峰形尖銳，經(jīng)系統(tǒng)摸索，最終確定流動(dòng)相為乙腈-水(50：50，V/V)。

2.6去水衛(wèi)矛醇衍生物的鑒定 取去水衛(wèi)矛醇對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)處理后，進(jìn)行LC-ESI-MS/MS分析，特征碎片離子以及質(zhì)譜裂解規(guī)律見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰為445.1，與衍生物中含偶數(shù)氮的情況相符，特征碎片離子包括m/z116.1和427.2，因此鑒定該色譜峰對(duì)應(yīng)的成分為去水衛(wèi)矛醇衍生物。去水衛(wèi)矛醇與DDTC的反應(yīng)示意圖見(jiàn)圖3。

圖2 去水衛(wèi)矛醇衍生物的特征碎片離子譜

Fig.2Ionmassspectraofdistinctiveproductdianhydrogalactitolderivative

圖3 去水衛(wèi)矛醇與DDTC的化學(xué)衍生化反應(yīng)示意圖

Fig.3ReactionpathwayofderivatizationofdianhydrogalactitolandDDTC

2.7方法學(xué)考察

2.7.1專屬性實(shí)驗(yàn) 空白干擾實(shí)驗(yàn)：分別取空白溶劑、去水衛(wèi)矛醇對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)操作后，進(jìn)行HPLC分析，典型的色譜圖見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，在本色譜條件下，去水衛(wèi)矛醇衍生物峰形良好，保留時(shí)間約為5.7 min，空白溶劑對(duì)主峰的測(cè)定無(wú)干擾。

A.空白溶液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.衍生物

圖4 衍生化去水衛(wèi)矛醇的典型高效液相色譜圖

A.blank solution；B.reference solution；C.sample solution；1.derivative

Fig.4RepresentativeHPLCchromatogramsofdianhydrogalactitolderivative

強(qiáng)制降解研究：取去水衛(wèi)矛醇10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，分別進(jìn)行酸破壞(0.1 mol·L-1鹽酸溶液1 mL，室溫2 h)、堿破壞(0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL，室溫2 h)、氧化破壞(3%過(guò)氧化氫溶液1 mL，室溫1 h)、高溫破壞(60 ℃ 2 h)和光照破壞(紫外燈下2 h)，用水稀釋至刻度，搖勻，按“2.4”項(xiàng)處理后，進(jìn)行HPLC分析，典型色譜圖見(jiàn)圖5。去水衛(wèi)矛醇在酸和氧化條件下有明顯降解，而在其他條件下較為穩(wěn)定。本品進(jìn)行制劑工藝改進(jìn)、藥效、藥動(dòng)學(xué)或毒理學(xué)研究時(shí)應(yīng)注意藥物的穩(wěn)定性。

2.7.2檢測(cè)限及定量限 精密稱取對(duì)照品適量，用水溶解并定量稀釋制成不同濃度的溶液，衍生化處理后進(jìn)行HPLC分析，去水衛(wèi)矛醇檢測(cè)限(S/N=3)和定量

A.酸破壞 ；B.堿破壞 ；C.氧化破壞；D.高溫破壞；E.光照破壞；F.未破壞；1.衍生物

A.acid degradation；B.alkaline degradation；C.oxidation degradation；D.heat degradation；E.light degradation；F.sample without destruction；1.derivative

Fig.5ReprehensiveHPLCchromatogramsofforceddegradationstudyondianhydrogalactitol

限(S/N=10)分別為30和100 ng·mL-1(n=5)。

2.7.3線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)照品適量，加水溶解并定量稀釋制成濃度分別為0.100，0.500，1.00，2.00，5.00，10.0及20.0 μgmL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.4”項(xiàng)處理后，進(jìn)行HPLC分析，以濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，去水衛(wèi)矛醇在0.100～20.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好，典型回歸方程為A=38 725C+755.19(r=0.999 8)。

2.7.4加樣回收率 精密稱取已測(cè)定含量的去水衛(wèi)矛醇原料約10 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置20 mL量瓶中，分別精密加入質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的去水衛(wèi)矛醇對(duì)照品溶液0.6，1.0，1.4 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，作為濃度水平80%，100%和120%的回收率溶液，每個(gè)濃度水平配制3份。按“2.4”項(xiàng)處理后，進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果見(jiàn)表1，加樣回收率為98.2%～101.3%，方法準(zhǔn)確度良好。

2.7.5精密度實(shí)驗(yàn) 供試品溶液經(jīng)衍生化反應(yīng)后，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的RSD為1.15%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.7.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 配制6份供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)處理后，進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果表明，6份樣品含量RSD為1.44%，重復(fù)性良好。

2.7.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將供試品溶液按“2.4”項(xiàng)處理后，分別于0，2，4，6，10 h進(jìn)行HPLC分析，與0h比較，不同時(shí)間峰面積在0 h峰面積的99.5%～100.8%范圍內(nèi)，去水衛(wèi)矛醇衍生物在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。另將供試品溶液在室溫下放置不同時(shí)間后，進(jìn)行衍生化HPLC分析，不同時(shí)間測(cè)定的含量在98%～102%，表明去水衛(wèi)矛醇水溶液在室溫至少可放置4 h。

表1 去水衛(wèi)矛醇加樣回收率結(jié)果

2.8含量測(cè)定 取對(duì)照品溶液及供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)處理后，進(jìn)行HPLC分析，典型色譜圖見(jiàn)圖4。按外標(biāo)法計(jì)算，樣品的平均含量為100.5%。

3 討論

去水衛(wèi)矛醇具有環(huán)氧環(huán)的特征結(jié)構(gòu)，可與DDTC發(fā)生衍生化反應(yīng)，生成具有紫外吸收的衍生物，用廣泛使用的紫外檢測(cè)器檢測(cè)。筆者考察不同溫度(25，40，60 ℃)、加熱時(shí)間(5，15，30，45，60，90和120 min)、衍生化試劑濃度(1%，2%，3%，5%和10%)以及不同反應(yīng)體系pH值(6.0，7.0和8.0)，發(fā)現(xiàn)藥物與5% DDTC在pH 值7.0條件下，于40 ℃水浴加熱30 min可衍生化完全。為了除去過(guò)量的衍生化試劑，避免其干擾衍生物的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)比較了乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚等試劑的萃取效率，發(fā)現(xiàn)乙醚和乙酸乙酯的效果最好，考慮到操作的簡(jiǎn)便性和安全性，最終選擇乙酸乙酯作為萃取劑。

筆者建立了衍生化HPLC法測(cè)定去水衛(wèi)矛醇含量，該方法線性范圍寬，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，簡(jiǎn)單易行，易于在普通實(shí)驗(yàn)室操作，不僅可用于去水衛(wèi)矛醇原料的質(zhì)量控制，還可用于去水衛(wèi)矛醇制劑和生物樣品的分析，對(duì)去水衛(wèi)矛醇的新藥開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)和臨床應(yīng)用具有重要的參考價(jià)值。