“一步法”制備核殼式Ag-MIP及對苯唑西林的SERS檢測

李軒，李利軍，程昊，馮軍，劉騰，徐婭娟

(1.廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545000；2.廣西科技大學 廣西糖資源綠色加工重點實驗室， 廣西 柳州 545006；3.廣西蔗糖產業協同創新中心，廣西 南寧 530004；4.廣西科技大學 廣西高校糖源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

抗生素是20世紀最重要的醫學發明之一，在治療許多致命的傳染病方面具有較好的效果，但抗生素藥物的過度使用導致抗藥性細菌增多，從而影響一些疾病的治療[1-3]。苯唑西林(Oxacillin)作為抗生素，常被用來治療病菌感染類疾病，但在動物的飼養過程中過量使用則會造成苯唑西林在動物性食品中殘留[4-6]，因此，建立快速、準確的苯唑西林檢測方法具有重要的意義。

目前，檢測苯唑西林的方法主要有高效液相色譜法[7]、液-質聯用(HPLC-MS)[8]和高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)[9]等方法，這些方法或比較繁瑣，或檢測周期長，無法實現快速檢測。表面增強拉曼散射(SERS) 利用光子作為分子探針，可以實現對物質的無損、快速檢測[10]。

本文以硅烷化試劑APTES為功能單體，苯唑西林為模板分子，TEOS為交聯劑，采用“一步法”制備核殼式Ag-MIP微球，以核殼式Ag-MIP微球為基底，利用激光共聚焦拉曼光譜儀，在638 nm激發波長處對苯唑西林溶液進行檢測，結果發現，核殼式Ag-MIP基底對苯唑西林具有較強的SERS信號，苯唑西林濃度和特征峰強度具有較好的線性關系，R2為0.975，檢測極限達到10-15mol/L。對相同濃度的4-MBA、R6G和苯唑西林混合溶液，Ag-MIP對苯唑西林具有較高的選擇性，可較好的排除4-MBA、R6G對SERS光譜采集的干擾。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

硝酸銀、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MW=55 000)、抗壞血酸、苯唑西林、硅酸四乙酯(TEOS)、3-氨基三乙氧基硅烷(APTES)、氨水、無水乙醇、乙腈均為分析純。

Hitachi S-4800冷場發射掃描電子顯微鏡；JEM 2100透射電子顯微鏡；Bruker D8A A25 X射線衍射儀；Frontier傅里葉紅外光譜儀；UV-2102PC紫外可見分光光度計；XploRAPLUS激光共聚焦拉曼光譜儀。

1.2 核殼式Ag-MIP微球制備

1.2.1 銀微球的制備[11]配制1 mol/L AgNO3溶液作為銀源，0.1 mol/L抗壞血酸溶液作為還原劑，1% PVP(聚乙烯吡咯烷酮)溶液作為分散劑。取0.2 mL AgNO3溶液與1 mL PVP溶液分散于10 mL去離子水中，磁力攪拌5 min。迅速滴加2 mL抗壞血酸溶液，反應10 min。離心，分別用去離子水與無水乙醇洗滌3次，40 ℃真空干燥24 h。

1.2.2 Ag-MIP的制備 稱取50 mg苯唑西林超聲分散于10 mL乙醇-乙腈(1∶1)溶液中，加入450 mL APTES，磁力攪拌30 min。加入200 mL TEOS，超聲10 min。加入200 mg Ag微球，超聲5 min，待Ag微球分散均勻后，加入6%氨水1 mL，常溫下磁力攪拌24 h。離心，用乙酸-水(4∶1)洗滌，直至無苯唑西林檢出。最后，分別用去離子水與無水乙醇洗滌3次，40 ℃真空干燥24 h。

1.2.3 Ag-NIP的制備 方法和上述完全相同，只是不加模板分子苯唑西林。

1.3 Ag-MIP吸附性能考察

配制不同濃度的苯唑西林標準溶液，建立標準曲線。分別取2 mL苯唑西林標準溶液與10 mg的Ag-MIP和Ag-NIP在25 ℃振蕩24 h，離心，取上清液，檢測其紫外吸光度。

1.4 拉曼光譜采集及參數

分別取2 mL不同濃度的苯唑西林標準溶液和苯唑西林、R6G、4-MBA混合溶液，分別與10 mg Ag和Ag-MIP混合，在25 ℃振蕩4 h。滴到石英玻璃片上，晾干，采集拉曼光譜。光譜的參數為：波長638 nm，積分時間10 s，平均次數為1次。

2 結果與討論

2.1 Ag-MIP的表征

2.1.1 Ag、Ag-MIP的SEM和TEM表征 圖1分別為Ag和Ag-MIP的SEM和TEM圖。

圖1 Ag和Ag-MIP的SEM和TEM圖Fig.1 SEM and TEM diagrams of Ag and Ag-MIPa.Ag SEM圖；b.Ag-MIP SEM圖；c.Ag TEM圖；d.Ag-MIP TEM圖

由圖1可知，銀微球是由棍棒組成，且表面非常粗糙，Ag-MIP中的Ag微球表面粗糙度降低，且觀察不到凸起的棍棒。Ag微球表面包覆了一層透光度較高的薄膜。綜上，可以初步確定銀微球表面覆蓋有聚合物層。

2.1.2 Ag-MIPs的EDS表征 圖2為Ag-MIPs 的EDS圖。其中的Ag元素譜峰來自于Ag微粒，Si來自于APTES或TEOS，C元素可能來自于APTES、TEOS或PVP。N、S元素來自于模板分子苯唑西林，由此可以進一步證明銀微球表面的聚合物為苯唑西林分子印跡聚合物。

圖2 Ag-MIP的EDSFig.2 EDS images of Ag-MIP

2.1.3 Ag、Ag-MIPs的XRD表征 圖3為Ag、Ag-MIP的XRD譜圖。

圖3 Ag-MIP(a)和Ag(b)的XRD譜圖Fig.3 XRD spectra of Ag-MIP (a) and Ag (b)

由圖3可知，在2θ=38.175，4.413，64.630，77.606°處出現了明顯的衍射峰，通過與標準PDF卡片(87-0720)對比，這些吸收峰分別為Ag晶體的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，Ag-MIP的特征峰位與Ag微球位置完全重合，說明Ag微球表面包覆一層聚合物后，并未導致銀微球晶型發生改變，但峰強度變小，其中(111)對應晶面峰的強度降低最大。

2.1.4 Ag、Ag-MIP的IR表征 圖4是Ag-MIPs和Ag的FTIR譜圖。

圖4 Ag-MIP(a)和Ag(b)的FTIR譜圖Fig.4 FTIR spectra of Ag-MIP (a) and Ag (b)

由圖4可知，Ag微球表面并無其它雜質；從Ag-MIP FTIR可看出，846，1 047 cm-1是來自交聯劑TEOS中的Si—O鍵的特征峰，1 400，1 470，1 470 cm-1是由苯唑西林中的苯環骨架振動引起的，1 550 cm-1是由苯唑西林中C—N鍵伸縮振動引起的，1 595，1 652 cm-1是由苯唑西林中的酰胺基中的羰基伸縮振動引起的。這些特征峰的出現，進一步證明Ag-MIP制備成功。

2.2 Ag-MIP的吸附等溫線

Ag-MIP和Ag-NIP的吸附等溫線見圖5。

圖5 Ag-MIP(a)和Ag-NIP(b)對苯唑西林的吸附等溫線Fig.5 Adsorption isotherm of Ag-MIP (a) andAg-NIP (b) for OXA

由圖5可知，在10～60 μg/mL的苯唑西林濃度區間內，Ag-MIP與Ag-NIP的吸附量均隨著濃度的增大而上升，但Ag-MIP吸附量遠高于Ag-NIP，表明Ag-MIP對苯唑西林具有更好的吸附性能，且吸附飽和量為23.6 μg/mg。這是因為Ag-MIP聚合物具有和苯唑西林分子結構相匹配的印跡空穴，從而導致了Ag-MIP對苯唑西林的吸附具有富集效果。

2.3 Ag-MIP的吸附動力學曲線

圖6為Ag-MIP和Ag-NIPs的動力學吸附曲線。

圖6 Ag-MIP(a)和Ag-NIP(b)的吸附量-時間曲線Fig.6 Adsorption quantity-time curve ofAg-MIP (a) and Ag-NIP (b)

由圖6可知，在60 min內隨時間增加，Ag-MIP和Ag-NIPs對苯唑西林的吸附速率增大，120 min后開始減緩，360 min時吸附達到飽和。在任何時間段內，Ag-MIP相對于Ag-NIP都具有較大的吸附速率。這是由于Ag-MIP聚合物中具有和苯唑西林分子結構相匹配的印跡空穴，所以Ag-MIP相對于Ag-NIP 表現出較高的吸附速率。

2.4 Ag-MIP的競爭吸附

圖7為Ag-MIP和Ag-NIP分別對OXA、4-MBA、R6G分子的吸附效率。

圖7 Ag-MIP和Ag-NIP對不同分子的競爭吸附研究Fig.7 Competitive adsorption of different moleculesby Ag-MIP and Ag-NIP

由圖7可知，在相同的條件下，Ag-MIP對苯唑西林的吸附效率為83.5%，明顯高于Ag-NIP的37.5%。Ag-MIP對4-MBA與R6G的吸附效率分別為50.6%，42.5%。表明Ag-MIP對苯唑西林吸附具有選擇性。這是因為Ag-MIP洗脫苯唑西林后，在Ag-MIP表面留下了與苯唑西林分子結構相匹配的空穴，空穴中有與苯唑西林相結合的官能團，從而導致了Ag-MIP對苯唑西林的吸附具有選擇性和富集效果。Ag-NIP對4-MBA與R6G的吸附效率分別為42.9%，25.9%，吸附效率相差較大。這是因為Ag-NIP表面的空穴是無規律排列的，沒有特殊結構的普通空穴，但4-MBA分子結構相對R6G較小，所以更容易被吸附。

2.5 Ag與Ag-MIP的SERS性能研究

圖8(a)、8(b)分別為苯唑西林(10-3mol/L)在Ag-MIP和Ag微球基底上的SERS譜圖，8(c)為苯唑西林標準品的拉曼光譜圖。

圖8 拉曼光譜圖Fig.8 Raman spectraa.苯唑西林(10-3mol/L)在Ag-MIP基底上的SERS；b.苯唑西林(10-3mol/L)在Ag微球基底上的SERS；c.苯唑西林標準品的SERS

由圖8(c)可知，Ag微球與Ag-MIP在1 092 cm-1(羧基C—O鍵伸縮振動引起)、1 195 cm-1(苯環C—H鍵彎曲振動引起)、1 600 cm-1(苯環C—C鍵伸縮振動引起)處拉曼峰顯著增強[12-13]，因此，可分別作為Ag微球與Ag-MIP基底上苯唑西林的特征峰。在相同濃度的苯唑西林溶液中，Ag-MIP的特征峰強度顯著高于Ag微球。這是因為Ag-MIP對苯唑西林的選擇性吸附，使Ag-MIP上的苯唑西林分子數量增大，所以具有較強的SERS信號。

2.6 Ag-MIP的SERS檢測極限

圖9是不同濃度苯唑西林溶液的SERS譜圖。

圖9 Ag-MIP吸附不同濃度苯唑西林溶液的SERS譜圖Fig.9 SERS spectra record for Ag-MIP in differentconcentration of OXA solution

由圖9可知，隨著苯唑西林濃度的降低，對應的峰強度也相應減弱。當苯唑西林溶液的濃度為10-15mol/L時，吸收峰強度極弱。這是由于隨著苯唑西林溶液濃度的降低，Ag-MIP吸附的苯唑西林分子減少，激光照到單位面積的苯唑西林分子也隨之逐漸減少，從而導致拉曼光譜的信號逐漸減弱。因此，可將10-15mol/L視為Ag-MIP的檢測極限。

為了考察不同濃度的苯唑西林與其SERS的線性相關性，以圖8中1 092 cm-1處的特征峰為參照，logc為橫坐標，特征峰強度為縱坐標，在濃度10-3～10-13mol/L 范圍內作線性擬合，見圖10。線性回歸方程為y=893.74x+12 221，R2=0.975。

由圖10可知，苯唑西林濃度與SERS信號峰強度之間存在較好的線性關系，說明可以通過測量特征峰強度實現對苯唑西林的定量分析。

圖10 濃度與峰強度的線性關系圖Fig.10 The liner relationship betweenconcentration and peak intensity

2.7 Ag-MIP的SERS競爭吸附

圖11分別是Ag和Ag-MIP吸附苯唑西林、4-MBA和R6G混合溶液后的SERS譜圖。

圖11 SERS譜圖Fig.11 SERS spectraa.苯唑西林、4-MBA和R6G混合溶液在Ag-MIP基底上SERS；b.苯唑西林、4-MBA和R6G混合溶液在Ag基底上的SERS

由圖11可知，在600～1 800 cm-1范圍內，以Ag-MIP作為基底時，苯唑西林的特征峰較為明顯，4-MBA和R6G的特征峰較低，基本被苯唑西林的特征峰覆蓋。而以Ag作為基底時，苯唑西林、4-MBA和R6G的特征峰都較為明顯。這是因為Ag-MIP聚合物中具有和苯唑西林分子結構相匹配的結合位點，可以選擇性吸附苯唑西林分子。對比圖8(a)，可知，苯唑西林的特征峰藍移，且相對強度也有所變化，這可能是少量的4-MBA和R6G吸附導致。

3 結論

采用“一步法”制備出核殼式Ag-MIP微球，粒徑均一，分散性好。以核殼式Ag-MIP微球作基底，對苯唑西林的拉曼光譜具有顯著的增強效應，同時對苯唑西林具有優異選擇吸附性，因此，可用于苯唑西林的高靈敏度、高選擇性的SERS檢測。