慢性丙型肝炎患兒外周血NK細胞抑制受體的表達及其臨床意義

張詠芳 楊俊梅

自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)是人體固有免疫細胞，具有抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節功能[1]。在NK細胞抵抗丙型肝炎病毒時，由于慢性丙型肝炎(CHC)細胞因子的暴露會誘導NK細胞毒性過度表達，導致正常的肝細胞損傷，影響病情的發展[2]。因此，NK細胞抑制受體的表達對CHC的診斷與治療有重要的意義。本研究通過對我院135例CHC患兒CD158b、CD159e及NKG2D表達水平分析，探討其與肝纖維化程度相關性。

資料與方法

一、一般資料

選取2015年1月至2018年1月我院收治的CHC患兒135例，其中男性75例，女性60例，平均年齡(5.5±0.7)歲。根據《丙型肝炎防治指南》[3]對丙型肝炎進行診斷。根據患者肝功能是否異常(ALT>40 U/L)將患者分為肝功能正常組(n=97)與肝功能異常組(n=38)，其中正常組97例，異常組38例；根據肝纖維化分期將患者分為S0～4期，其中S0期36例、S1～2期68例、S3～4例31例。納入標準為：(1)血液中HCV RNA持續存在，大于6個月；(2)年齡低于14歲。排除標準：(1)甲型、乙型、丁型、戊型肝炎；(2)藥物性肝炎；(3)酒精性肝炎；(4)肝癌患者。所有患兒及其家屬均對本研究知情同意，并簽署知情同意書。本研究獲得我院醫學倫理委員會批準同意。

二、方法

(1)收集患兒性別、年齡、感染途徑、病毒基因型、肝硬化及抗病毒治療情況等資料。

(2)肝功能檢測 采集患兒靜脈血4 mL，采用AU2700全自動生化分析儀(OLYMPUS)檢測丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase，ALT)。ALT正常值上限為40，肝功能異常(ALT>40 U/L)[4]。

(3)HCV RNA載量測定 采用RT-PCR檢測血清HCV RNA病毒載量(合肥萊爾生物)。

(4)CD158b、CD159e及NKG2D檢測 在肝活檢時采用流式細胞儀檢測NK細胞，將NK細胞表面抗原用患者PBMC與抗CD158b( KIR2DL2 / DL3)-藻紅素(PE)(人；克隆dx27)，抗CD159e(KIR3DL1)-PE(人；克隆DX9)共同孵育，激活受體。通過同種對照染色確定背景染色水平，用裂解液溶解紅細胞和淋巴細胞， NK細胞受體通過流式細胞儀檢測。

(5)肝纖維化評定 肝組織活檢：在B超引導下行肝穿刺，取組織長度>1.0 cm，10%甲醛浸泡送病理科檢驗，由本院2名經驗豐富的病理科醫師采用S分期評估肝纖維化程度，將其分為S0～S4。采用EPIQ7彩色多普勒超聲診斷儀(荷蘭飛利浦)檢查肝表面光滑度和肝實質回聲情況，并對其進行評分。若肝表面光滑度和肝實質回聲各為3分，綜合肝表面光滑度和肝實質回聲情況計算肝纖維化程度評分，評分越高代表纖維化程度越嚴重[5]。

三、統計學分析

采用SPSS 19.0統計學軟件處理數據，CD158b、CD159e及NKG2D等資料采用(均數±標準差)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用S-N-K檢驗；年齡等計數資料用n(%)表示，采用卡方檢驗；相關性采用Pearson卡方分析；采用受試者工作特征曲線(ROC)分析CD158b、CD159e及NKG2D診斷晚期肝纖維化的效能。檢驗標準：α=0.05。

結 果

一、 CHB患兒肝功能正常組與肝功能異常組血清CD158b、CD159e及NKG2D水平比較

由表1數據可知，肝功能異常患兒血清CD158b、CD159e及NKG2D水平均明顯高于肝功能正常患兒(P<0.05)。

二、 CD158b、CD159e及NKG2D相關性分析

CD158b與CD159e及NKG2D均呈正相關(r=0.195、0.387，P=0.023、0.000)，CD159e與NKG2D呈現正相關(r=0.493，P<0.001)。

表1 肝功能正常組與肝功能異常組外周血NK細胞抑制受體表達水平比較

三、 CD158b、CD159e及NKG2D在不同肝纖維化程度中的表達水平比較

S0、S1～2、S3～4組患者血清CD158b、CD159e及NKG2D比較差異有統計學意義(P<0.05)；其中S0組患者血清CD158b、CD159e及NKG2D均明顯低于S1～2組(q=7.735、5.532、4.997，均P<0.05)，S1～2組CD158b、CD159e及NKG2D水平明顯低于S3～4組(q=8.372、7.587、5.743，均P<0.05)。

四、 CD158b、CD159e及NKG2D與臨床病理的關系

結果提示，CD158b、CD159e及NKG2D在患兒性別、年齡、病毒感染途徑、病毒基因型分布上比較差異無統計學意義(P>0.05)；而在肝硬化及未接受抗病毒治療患兒的血清水平明顯升高。

五、 CD158b、CD159e及NKG2D與肝纖維化程度相關性

135例CHC患兒肝纖維化程度評分為(2.7±0.6)分，相關性分析顯示，CD158b、CD159e及NKG2D與肝纖維化程度呈正相關(r=0.332、0.465、0.275，均P<0.05)，提示，三者水平均隨肝纖維化程度加重而升高。

圖1A：CD158b與CD159e散點圖；1B：CD158b與NKG2D散點圖；1C：CD159e與NKG2D散點圖

圖1CD158b、CD158e及NKG2D相關性散點圖

表2 CD158b、CD158e及NKG2D在不同肝纖維化程度中的表達水平比較

六、 CD158b、CD159e及NKG2D聯合檢測診斷嚴重肝纖維化(S4)的效能分析

單指標診斷嚴重肝纖維化時，NKG2D診斷的效能最高，其次為CD158b，CD159e最差；CD158b、CD159e及NKG2D聯合檢測診斷嚴重肝纖維化的的Logistic回歸方程為F=-21.850+0.131CD158b+0.276CD158e+0.124NKG2D，其診斷嚴重肝纖維化的效能高于單指標診斷，AUC聯合檢測>AUCCD158b，AUC聯合檢測>AUCCD159e，AUC聯合檢測>AUCNKG2D(Z=3.332、3.031、2.956，P=0.001、0.002、0.003)。

討 論

據估計目前全世界約有2億CHC患者是由HCV感染引發，其中70%～80%CHC患者會發展為肝纖維化[6]。近年來，NK細胞與肝纖維化的關系日益受到關注，有研究表明激活NK細胞抑制受體的表達與肝纖維化的嚴重程度相關[7]。因此本文通過探討NK細胞抑制受體的水平變化特點與CHC患者肝纖維化程度的關系，以期為CHC患者的病情及肝纖維化程度判定提供新的方法。

表3 CD158b、CD158e及NKG2D與臨床病理的關系

表4 CD158b、CD159e及NKG2D聯合檢測診斷嚴重肝纖維化的效能

圖2 CD158b、CD159e及NKG2D聯合檢測診斷嚴重肝纖維化的ROC曲線

本研究選取的135例CHC患兒中，肝功能異常組血清中NK抑制受體的表達水平明顯高于肝功能正常組，提示肝功能異常會導致CD158b、CD159e及NKG2D表達水平升高。HCV對肝臟的感染會導致機體免疫力降低[8]，加重肝纖維化。本研究結果顯示，隨著肝纖維程度的加重，NK細胞抑制受體CD158b、CD159e及NKG2D表達增加，可能原因是各種致病因子導致肝內締結組織異常增生，致使CD158b、CD159e及NKG2D表達水平增高，降低NK細胞抗病毒的活性，導致機體對抗病毒的能力下降，提示肝纖維化程度的加重會導致NK細胞的活性降低，致使機體自身免疫功能下降，與Li等[9]研究結果一致。本研究病理資料分析結果表明，CD158b、CD159e及NKG2D的水平在肝硬化及未接受抗病毒治療患兒的水平升高，提示CD158b、CD159e及NKG2D表達水平與嚴重肝纖維程度有關。除此之外，若CHC未接受抗病毒治療，其機體NK細胞抵抗丙型肝炎病毒時，由于慢性丙型肝炎細胞因子的暴露會誘導NK細胞毒性過度表達，因此CD158b、CD159e及NKG2D表達水平升高，與Mania A等[10]研究結果一致。本研究結果顯示，不同嚴重程度肝纖維化患者CD158b、CD158e及NKG2D水平差異明顯，其水平隨肝纖維化程度的加重而升高，提示CD158b、CD158e及NKG2D有望成為判別肝纖維化分期的診斷指標。ROC曲線分析顯示，NKG2D診斷嚴重肝纖維化的效能良好，敏感度及特異性均較高；而CD158b、CD159e單項診斷嚴重肝纖維化的效能均低于NKG2D對嚴重肝纖維化的診斷效能，提示CD158b、CD159e和NKG2D單指標對嚴重肝纖維化均有較好的診斷效能，NKG2D的診斷準確率更好，可以作為肝纖維化程度診斷的指標。本研究將CD158b、CD159e及NKG2D聯合診斷與三者單獨診斷進行比較，結果顯示，CD158b、CD159e及NKG2D聯合檢測診斷嚴重肝纖維化的診斷效能明顯高于CD158b、CD159e或NKG2D單指標診斷效能，且三者聯合診斷模型對嚴重肝纖維化具有較好的敏感度及特異性，提示CD158b、CD158e及NKG2D聯合診斷模型有助于嚴重肝纖維化的早期的診斷。

綜上所述，CD158b、CD159e及NKG2D在CHC肝纖維化患兒體內表達水平較高，且隨著患者肝纖維化程度的加重而升高。三者聯合檢測能夠較為準確地評估肝纖維化程度，有助于嚴重肝纖維化的早期的診斷。然而本研究樣本量較少，且NK細胞抑制受體在肝纖維化過程的表達機制尚不完善，下一步將擴大樣本量，并完善其表達機制。