新疆裸重唇魚和斑重唇魚遺傳多樣性分析

趙雪飛 ，米博翰 ，梁利群 ，馬勇強 ，孫博 ，常玉梅

（1.東北林業大學野生動物資源學院，黑龍江 哈爾濱150040；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱150070；3.上海海洋大學水產與生命學院，上海201306；4.新疆新源縣普祿科生態農業有限公司，新疆 新源830000）

新疆裸重唇魚Gymnodiptychus dybowskii和斑重唇魚Diptychus maculates同屬裂腹魚亞科Schizothoracinae，同為特化等級的裂腹魚類[1]。前者屬裸重唇魚屬Gymnodiptychus，又稱裸黃瓜魚，分布于我國伊犁河流域和準噶爾盆地等水域，為新疆維吾爾族自治區I級水生野生保護動物；后者屬重唇魚屬Diptychus，又稱斑黃瓜魚，分布于新疆塔里木河水系伊犁河流域，為新疆維吾爾族自治區II級水生野生保護動物[2～4]。

21世紀初由于人類生產活動和利益驅使，新疆裸重唇魚和斑重唇魚等一些珍稀魚類遭過渡捕撈，資源遭到嚴重破壞[5]。為了保護這兩種魚類資源，在伊犁河流域上多座水利水電工程建設中開展了相應的人工救護和增殖放流工作[6]，并對已建水電站進行水生生物及環境監測，控制外來物種入侵,嚴格按照相關法規進行增殖放流，保護新疆土著魚類[7]。目前對這兩個物種的研究多集中于野外調查和種群進化等研究[8～11]，對其種內遺傳多態性的研究尚未見報道。

新疆裸重唇魚和斑重唇魚體表均裸露幾乎無磷，野外群體空間分布具有較高的重疊性和相似性，當地人統稱兩種魚類為棒子魚[12]，針對兩物種的分子遺傳學研究未見報道。本研究在已發表的文獻中選用與兩種魚為同亞科的其他魚類的微衛星標記共51對，分別對兩個物種的群體DNA樣本進行PCR擴增，分析兩物種種群的種內多態性與種間遺傳距離，同時篩選出可用于這兩個物種種質鑒定的分子標記，以期為兩個物種的種群保護提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年12月，在新疆新源縣普綠科生態農業有限公司，分別采集來自鞏乃斯河上游恰普河的斑重唇魚（BCC）、新疆裸重唇魚（LCC）各 15尾，剪取部分腹鰭組織，置于95%乙醇中保存。

1.2 方法

1.2.1 微衛星引物

本研究所用的51對引物分別來自郝卓然、段鵬翔及楊天燕等已發表的文獻[13～15]，由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。同時對兩物種中隨機選取的3個樣本，進行PCR擴增穩定性及多態性進行檢測，選擇適宜的微衛星標記共16個，檢測全部30個樣本的多態性（表1）。

1.2.2 PCR擴增

采用標準酚-氯仿法，提取鰭條樣品的DNA，用Thermo Nano Drop 8000分光光度計測量濃度，稀釋樣本濃度至10ng/μL備用。

PCR 擴增體系為 25μL，包括 2×mix 12.5μL，上下游引物各（10mmol/L）1μL，基因組 DNA 2μL，滅菌ddH2O補齊。PCR擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性 45s，退火 45s，72℃延伸 1min，35 個循環；最后再72℃延伸10min，4℃保溫，退火溫度依引物而定（表1）。擴增反應在ABI Veriti96梯度PCR儀上完成。取1μLPCR擴增產物于8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離(140 V，3.5～4h)，銀染顯色后拍照記錄，分子量標準為DL2000。

1.2.3 數據分析

用Gel-Pro Analyzer 4.5軟件分析電泳條帶大小。經電泳獲得的基因指紋圖譜在引物擴增的片段大小范圍內，將有正確擴增條帶的標記用作分析各物種種群的種內多態性，只有單一物種出現擴增條帶的標記可用作兩物種的種質鑒定。

用Pop Gene32軟件統計微衛星標記的等位基因數（Allele Number，N）、有效等位基因數（Effective number of allele，Ne）、觀測雜合度（Observed heterozygosity，H）以及期望雜合度（Expected oheterozygosity，He）。采用Pop Gene32軟件進行χ2檢驗估計群體的Hardy-Weinberg平衡偏離，同時統計并計算了Nei氏遺傳距離、遺傳相似系數（Genetic similarity index，I）、基因流（Nm）、群體間近交系數（FST）和多態信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）等遺傳參數。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果與分析

51個微衛星標記對BCC和LCC兩個群體的30尾樣本進行PCR擴增，篩選出可用標記為16對。其中可用于BCC種內多態性分析的標記共13個（HLJ3919、HLJ2228、BW014、HLJ3795、HLJ2217、HLJ2265、HLJ3138、TLM22、QK45、TLM10、HLJ2433、HLJ2510和 HLJ2376），標記 HLJ3481和HLJ2147均只有一條帶，標記BWY05帶型較雜，可用于兩物種的種質鑒定，不能用于BCC的種內多態性分析；可用于LCC種內多態性分析的標記為4個（HLJ3919、HLJ2229、HLJ2147 和 HLJ2217），除用于種質鑒定的標記不能被擴增出條帶外，LCC在其他標記均為單一條帶，無多態性；可用作兩物種種質鑒定的標記為 HLJ3481、HLJ2433、HLJ2510、HLJ2376和BWY05等5個標記，這5個標記均只能擴增物種BCC。全部標記擴增出穩定而清晰片段的長度內103～534bp，部分標記的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜見圖1。

表1 微衛星引物序列及擴增情況Tab.1 The sequences and am plification condition ofm icrosatellitemarkers

2.2 兩個物種的遺傳參數分析

用Popgen32軟件計算統計了斑重唇魚和新疆裸重唇魚兩物種的多個遺傳參數（表2）。結果發現：兩群體平均等位基因數（N）分別為2.375和1.75，平均有效等位基因數（Ne）分別為1.879和1.504，平均觀測雜合度（Ho）分別為0.454和0.367，平均期望雜合度（He）分別為0.397和0.245。將每個標記的等位基因數與有效等位基因數；觀測雜合度與期望雜合度進行成對樣本的T檢驗。結果顯示：BCC和LCC的等位基因數與有效等位基因數差異顯著（P＜0.05），而觀測雜合度與期望雜合度差異則為BCC顯著（P＜0.05），LCC不顯著（P=0.128）。Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，僅LCC群體在標記HLJ2147極顯著偏離平衡，表現為雜合子過剩。

圖1 部分標記的電泳圖譜Fig.1 Partial labeled electrophoretic maps

表2兩個物種在14個標記上的遺傳多樣性參數Tab.2 Genetic diversity parameters of the two species at 16m icrosatellitemarkers

斑重唇魚的多態信息含量（PIC）范圍在0.180～0.616之間，新疆裸重唇魚的多態信息含量（PIC）范圍在0.124～0.740之間，根據Botstein等[16]對標記多態水平的劃分標準，BCC和LCC分別有3個和1個標記為低度多態（0＜PIC≤0.25），各占整體的23.1%和25%；各有6個和1個標記為中度多態（0.25≤PIC＜0.5），占整體的46.2%和25%；各有4個和2個標記為高度多態（PIC≥0.5），各占整體的30.7%和50%。BCC和LCC的平均多態信息含量分別為0.433和0.461，雖然新疆裸重唇魚的平均PIC要高于斑重唇魚，但前者的可用微衛星標記較少，與斑重唇相比，新疆裸重唇魚在多個微衛星標記均無多態性。因此，整體來看，斑重唇魚種群的多態水平要高于新疆裸重唇魚。

2.3 兩個物種的遺傳分化分析

選取共11個標記用作斑重唇魚和新疆裸重唇魚的遺傳分化分析（HLJ3919、HLJ2228、BW 014、HLJ2147、HLJ3795、HLJ2217、HLJ2265、HLJ3138、TLM22、QK45和TLM10）。得到兩物種的群體間近交系數（FST）平均值為0.357，表明35.7%的遺傳差異來自群體間，基因流（Nm）平均值為0.451，遺傳相似系數（I）平均值為0.782。兩物種之間的遺傳距離為0.520。利用UPGMA法構建的群體遺傳關系聚類圖顯示，兩個種群分別聚為一支，表面兩個種群間不存在雜交現象（表3）。

表3 群體間遺傳距離與遺傳相似度Tab.3 Nei's genetic distance(above diagonal line)and genetic identity(below diagonal line)

3 討論

2003至2007 年，馬燕武等[17]曾全面調查了新疆塔里木河水系土著魚類的種類和分布,發現塔里木河水系土著魚類的大尺度、大空間格局上分布均有縮小趨勢，僅在開都河水系發現有新疆裸重唇魚分布，范圍較以往狹窄。蔡林鋼等[7]也于2012—2014年連續3年調查了新疆伊犁河上、中和下游不同河段的魚類資源，發現伊犁河上游河段魚類種類稀少，大中型魚類資源更為稀少，優勢種多以體型較小的冷水性土著魚類為主，魚類多樣性較低，群落已受到干擾。可見斑重唇魚和新疆裸重唇魚的天然種群生存狀況并不樂觀。本研究對兩種群種內多態性的研究結果與野外調查結果相符，新疆裸重唇魚雖然在4個微衛星標記顯示種內多態性相對高于斑重唇魚，但在斑重唇魚的13個微衛星標記中，有10個標記均只能擴增出單一條帶，遺傳背景相對單一，可見，新疆裸重唇魚種內多態性要低于斑重唇魚，應加強對其野外資源的保護力度。而斑重唇魚的種內多態性分析結果雖然相對高于新疆裸重唇魚，但對伊犁河上游河段調查發現的小型化和低齡化等情況仍不容忽視。因此對于這兩種曾較廣泛分布于新疆的魚類，其野外種群數量和遺傳多樣性的保護工作仍需繼續加強。

本研究通過篩選用于評估新疆裸重唇魚和斑重唇魚種內多態性評估的微衛星標記共14個，發現可用于兩物種種質鑒定的微衛星標記5個，并分別分析了兩物種的種內多態性等,發現新疆裸重唇魚在多個標記均不具有多態性，遺傳背景較單一，而斑重唇魚的種內多態性雖然相對較高，但其野外種群的生存狀況并不樂觀。針對新疆裸重唇魚和斑重唇魚的野外種群保護雖然已采取了一定的措施，但尚有許多工作還需進一步開展。