釀酒酵母ICT1基因敲除對其耐鹽性的影響

王金鵬，韋元琪，朱 紅，錢偉祎，馬翔宇，崔 崟，周 華，蔡 恒*

（南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800）

酵母作為發(fā)酵工業(yè)中常用的菌株之一，在發(fā)酵過程中，自身代謝易受環(huán)境的影響，如高鹽會導致細胞內水分活度降低、細胞質組成發(fā)生變化并伴隨細胞膜損傷等，從而使發(fā)酵過程難以進行。但是，在發(fā)酵某些產品的后期，采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵能改善產品的風味與口感，閆美[1]研究發(fā)現，在醬油釀造的發(fā)酵后期添加耐鹽酵母進行高鹽稀態(tài)發(fā)酵，明顯改善了醬油的口感。謝韓等[2]在發(fā)酵醬油過程中添加耐鹽酵母，醬油的風味變得鮮甜適口，酯香濃郁。此外，在醫(yī)學上耐鹽酵母可作為模式菌研究離子通道疾病如高血壓、心血管疾病等[3-4]。因此，從自然界中篩選出具有優(yōu)良耐鹽性能的酵母菌株，并對其耐鹽機理進行研究在工業(yè)生產菌株性狀的改造[5]和藥物研發(fā)[6]方面都具有重要意義。

近年來對酵母耐鹽機理的研究已取得突破性進展。高鹽使酵母細胞內積累過量有毒陽離子，同時造成一定的滲透壓，使質膜因細胞缺水而皺縮[7]。在鹽脅迫條件下，酵母細胞通過多種復雜的信號傳導途徑將外界刺激傳入細胞核內，激活特異性轉錄因子引發(fā)鹽脅迫應答反應，包括：將有毒陽離子排出胞外，提高質膜對陽離子的選擇性吸收，如吸收K+[8-9]；調節(jié)一些相溶性物質的積累，如海藻糖[10]、麥角固醇[11]、甘油[12-13]等，維持細胞一定的滲透壓。此外，細胞膜的成分變化以及膜完整性也會對酵母耐受能力產生一定的影響[14-15]，所以對細胞膜相關基因的研究也是一個熱點。趙經文等[16-17]研究發(fā)現，在酵母質膜和細胞器表面都存在相應的離子轉運體，主要負責運輸K+、Na+等金屬陽離子，并且膜上可能還存在特定的蛋白能幫助這些離子通道蛋白正確定位。ICT1基因編碼的蛋白屬于α/β水解酶蛋白，對其結構進行分析發(fā)現，含有脂質結構域和脂肪酶水解酶/?；D移酶域[18]?；谠摪l(fā)現，GHOSH A K等[19]對ICT1與磷脂代謝的關系進行了研究，推測出一種可溶性脂質生物合成途徑：在烷烴暴露條件下，誘導了基因ICT1的表達以及磷脂的合成，最終促使了細胞膜的修復。HUAL等[20]研究發(fā)現，細胞膜成分相關基因ICT1的敲除與過表達能夠提高酵母對烷烴極端環(huán)境的耐受性。因此，ICT1作為影響膜成分的基因，對酵母的耐受性至關重要。

本研究以釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）BY4741作為出發(fā)菌，采用同源重組技術構建ICT1基因缺失釀酒酵母菌株，分析ICT1基因敲除對酵母耐鹽性的影響，并分別采用梯度點滴實驗、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色法、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time-quantitativepolymerase chain reaction，RT-QPCR）等技術分析ICT1基因在釀酒酵母耐鹽機制中的作用。以期為后續(xù)酵母耐鹽機理的解析提供一定的理論基礎，并對濃醪發(fā)酵工業(yè)生產菌株性狀的改造具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質粒

釀酒酵母（S.cerevisiae）BY4741：中國普通微生物菌種保藏管理中心；質粒pUG6（攜帶Kanr抗性基因，兩端帶有l(wèi)oxP位點，具有G418抗性）：廣西大學杜麗琴教授惠贈。

1.1.2 引物

根據釀酒酵母基因組數據庫（Saccharomycesgenome database，SGD）中ICT1基因（S000004089）和GenBank的pUG6序列（AF298793.1）設計引物，敲除引物命名為QC-F、QC-R，驗證引物為A/YZ-a、YZ-b/B。引物均由南京金斯瑞有限公司合成，所涉及的引物及其序列見表1。

表1 實驗所用引物的序列Table 1 Sequences of primers used in the experiment

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH。去除瓊脂即為YPD液體培養(yǎng)基。

篩選培養(yǎng)基：每50 mL YPD培養(yǎng)基中加入500 μL質量濃度為10 mg/mL的G418母液。

鹽濃度梯度培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基中分別加入不同終濃度的NaCl（0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L）。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L。

以上培養(yǎng)基均需在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20min。

1.1.4 試劑

rTaq酶、PrimeSTAR@Max脫氧核糖核酸（deoxyri bonucleic acid，DNA）Polymerase（酶活2.5 U/μL）、DL2000 DNA Marker、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+plus）、5×PrimeScript RT Master Mix、2×qPCR Master Mix、ROXI染料、質粒小量提取試劑盒、小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：日本TaKaRa公司；基因提取試劑盒、G418：生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

TRGADIENT聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；GPXcell 10-3000V電轉儀、170-8170凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；5804R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；leica DM2500IED熒光顯微鏡：德國徠卡公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 ICT1基因敲除組件的構建

以質粒pUG6為模板，采用引物QC-F、QC-R進行PCR擴增，獲得同源臂ICT1基因敲除組件。PCR擴增產物含G418抗性基因（kanr）及ICT1同源臂基因，堿基長度約1 800 bp。

PCR擴增體系：PrimeSTAR@Max DNA Polymerase 1 μL、dNTP 8 μL、5×Prime STAR Buffer 20 μL、QC-F 2 μL、QC-R2μL、DNA模板1μL，雙蒸水（ddH2O）補充至100 μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

參照SAMBROOK J等[21]所述方法制備釀酒酵母感受態(tài)細胞。將含G418抗性（Kanr）及ICT1同源臂的PCR擴增產物（約400ng）加入新制備的100μL釀酒酵母感受態(tài)細胞中，混勻，轉移至電轉杯后冰預冷5 min，電轉化（電擊參數：電壓1.5 kV，電容25 μF，電阻400 Ω，電擊間距2 mm）。電轉化結束后立即加入1mL冰預冷的山梨醇復蘇，混勻，8000r/min離心1 min，棄上清，取100 μL濃縮液涂布于含100 μg/mL G418的YPD固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～3 d。

1.3.2 ICT1基因敲除重組菌的篩選與驗證

挑取單菌落接種于含100 μg/mL G418的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下搖床培養(yǎng)12 h后，8 000 r/min離心1 min，收集菌體。采用基因提取盒試劑盒提取重組菌的基因組DNA，以其為模板，A/YZ-a和B/YZ-b為引物分別進行PCR擴增，對ICT1基因敲除菌進行驗證。PCR擴增體系：引物A/YZ-a（B/YZ-b）各2μL，Buffer2μL、rTaq酶10μL、DNA模板1 μL，雙蒸水（ddH2O）補充至20 μL。PCR擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，50℃（55℃）退火30 s，72℃延伸1min（2min），共30個循環(huán)；72℃再延伸10min。將PCR擴增產物送至南京金斯瑞公司測序。

引物對A/YZ-a、B/YZ-b以及整合“l(fā)oxP-kanMX-loxP”組建后的基因組相對序列如圖1所示。

圖1 引物與整合后的序列的相對位置關系Fig.1 Relative position relationship between primer and the integrated sequence

1.3.3 鹽耐受性試驗

種子液的制備：將出發(fā)菌BY4741和驗證成功的重組菌分別接種于10mLYPD液體培養(yǎng)基和含100 μg/mLG418的10mLYPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下搖床培養(yǎng)12 h后，采用無菌生理鹽水調整至相同菌體濃度。

耐鹽性測定：出發(fā)菌BY4741和重組菌的種子液經梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）稀釋后，取3 μL稀釋液分別接種于含0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/LNaCl的YPD平板上，30℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌體生長情況。

1.3.4 麥角固醇含量的測定[22]

麥角固醇標準曲線的繪制：以石油醚為溶劑制備質量濃度為0.1g/L的麥角固醇標準溶液；分別取標準溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于10 mL容量瓶中，石油醚定容至10 mL，在波長280 nm處測定OD280nm值。以OD280nm值（y）為縱坐標，麥角固醇質量濃度（x）為橫坐標，繪制麥角固醇標準曲線。

麥角固醇的提取：菌株BY4741和BY4741-ΔICT1在含不同濃度NaCl的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h后，分別取10 mL出發(fā)菌BY4741和重組菌BY4741-ΔICT1的菌液離心，8000r/min離心1 min，取沉淀，冰預冷的去離子水洗滌2次后轉入到50 mL錐形瓶中。加入2 g KOH、30 mL無水甲醇和5 mL無水乙醇，通入氮氣防止氧化。75℃水浴提取30 min后取出，待冷卻后加入10 mL去離子水和10 mL石油醚進行麥角固醇的萃取，劇烈振蕩10 min，靜置1 h，過濾。

麥角固醇含量的測定：吸取萃取試樣，測定其在波長280 nm處的吸光度值，根據麥角固醇標準曲線回歸方程計算麥角固醇含量，進而得出單位質量細胞內麥角固醇含量。

1.3.5 細胞膜完整性的測定[23]

將出發(fā)菌BY4741和重組菌BY4741-ΔICT1接種于含1.0 mol/L NaCl的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下搖床培養(yǎng)至對數期，經碘化丙啶（PI）染色后，采用熒光顯微鏡觀察兩株菌細胞膜的受損情況。

1.3.6 實時熒光定量PCR

按照Takara試劑盒步驟在4℃條件下提取重組菌的總核糖核酸（ribonucleicacid，RNA），以其為模板反轉錄為cDNA。反轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）擴增體系：5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL、RNA模板1 μL，雙蒸水（ddH2O）補充至20μL。RT-PCR擴增程序：37℃反轉錄15min；85℃熱變性30s；4℃保存。根據所測離子轉運體基因ENA1和NHA1的序列設計RT-QPCR引物，引物信息見表2。

表2 實時熒光定量PCR所用引物Table 2 Primers used for RT-QPCR

RT-QPCR擴增體系：2×qPCR Master Mix 10 μL、正向引物（10μmol/L）0.2μL、反向引物（10μmoL/L）0.2 μL、ROXI染料 0.4 μL、cDNA 2 μL，ddH2O補充至20 μL。RT-QPCR擴增曲線：95 ℃，5 min，1個循環(huán)；95 ℃，5 s；60 ℃，31 s，40個循環(huán)；熔解曲線：95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；95 ℃，15 s。

2 結果與分析

2.1 ICT1基因敲除組件的構建

以質粒pUG6為模板，采用引物QC-F、QC-R進行PCR擴增，獲得同源臂ICT1基因敲除組件，結果見圖2。

圖2 ICT1基因敲除組件PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR amplification products ofICT1gene knockout component

由圖2可知，PCR擴增產物的堿基長度約為1 800 bp，說明ICT1基因敲除組件構建成功。

2.2 ICT1基因敲除重組菌株的構建

采用電轉化法將ICT1基因敲除組件轉化至釀酒酵母BY4741中。由于ICT1基因敲除組件中包含異源顯性的Kanr標記基因，將ICT1基因敲除組件轉化至酵母細胞后，其兩端與酵母基因組同源的序列進行同源重組，最終以loxP-Kanr-loxP取代基因組中的ICT1基因，從而賦予轉化子G418抗性。在含G418的YPD平板上培養(yǎng)2～3 d后獲得轉化子，結果見圖3。

圖3 ICT1基因敲除重組菌株Fig.3 Recombinant strains withICT1gene knockout

由圖3可以看出，在含G418的YPD平板上明顯長出了轉化子，但為避免假陽性的存在，進行進一步的驗證。

2.3 ICT1基因敲除重組菌的驗證

提取轉化子BY4741-ΔICT1的基因組，分別以A/YZ-a、B/YZ-b為引物進行PCR擴增。正確整合了ICT1基因敲除組件的細胞以引物對A/YZ-a為引物時，可得到堿基長度為250 bp左右的PCR擴增產物，以引物對B/YZ-b為引物時，可得到堿基長度為850 bp左右的PCR擴增產物。PCR擴增結果見圖4。

圖4 ICT1基因敲除重組菌株的驗證Fig.4 Verification of recombinant strain withICT1gene knockout

由圖4可知，以引物對A/YZ-a為引物時，PCR擴增產物堿基長度為250 bp左右；以引物對B/YZ-b為引物時，PCR擴增產物堿基長度為850 bp左右，與預測結果一致，說明轉化子BY4741-ΔICT1中的ICT1基因已被敲除。

將PCR擴增產物送至南京金斯瑞有限公司測序，測序結果經比對后發(fā)現，ICT1基因敲除組件已被完全整合到染色體上，進一步說明ICT1基因已被敲除。

2.4 菌株BY4741和BY4741-ΔICT1的鹽耐受性測定

不同稀釋度的出發(fā)菌BY4741和重組菌BY4741-ΔICT1在鹽濃度梯度培養(yǎng)基上的生長情況見圖5。

圖5 菌株BY4741與BY4741-ΔICT1在不同NaCl濃度平板上的生長情況Fig.5 Growth situation of strain BY4741 and BY4741-ΔICT1on the plates with different NaCl contents

由圖5可知，與出發(fā)菌BY4741相比，重組菌BY4741-ΔICT1對NaCl更為敏感。經0.4 mol/L NaCl處理后，兩株菌的生長趨勢較為接近，隨著NaCl含量的增加，重組菌BY4741-ΔICT1的生長明顯受到抑制，說明ICT1基因的敲除提高了釀酒酵母對鹽的敏感性。

2.5 菌株BY4741和BY4741-ΔICT1在不同鹽濃度下麥角固醇含量的測定

以麥角固醇質量濃度（x）為橫坐標，OD280nm值（y）為縱坐標，繪制麥角固醇的標準曲線，經線性回歸擬合后得到的回歸方程為y=24.286 6x+0.055 6，R2=0.999 2，說明麥角固醇質量濃度與OD280nm值呈良好的線性關系，可用于麥角固醇含量的測定。

麥角固醇是酵母細胞膜中的主要成分之一，能夠影響細胞膜的滲透性和流動性，麥角固醇含量變化可影響膜內外物質的輸送[24]。菌株BY4741和BY4741-ΔICT1在含不同濃度NaCl的YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，測定菌株胞內麥角固醇的含量，結果見圖6。

由圖6可知，隨著NaCl濃度在0～1.0 mol/L范圍內的增加，出發(fā)菌BY4741胞內麥角固醇含量雖有所下降，但下降幅度較小，僅下降了11.2%；而重組菌BY4741-ΔICT1胞內麥角固醇含量下降趨勢較為明顯，下降了66.9%。出發(fā)菌BY4741和重組菌BY4741-ΔICT1胞內麥角固醇含量在不含NaCl的條件下差異不顯著（P＞0.05），但隨著NaCl濃度的升高，兩株菌的胞內麥角固醇含量差異越大。結果表明，BY4741-ICT1基因的敲除使得胞內麥角固醇合成減少，降低了細胞膜的穩(wěn)定性，使得酵母在高鹽環(huán)境下難以生存。

圖6 不同NaCl濃度下菌株BY4741和BY4741-ΔICT1胞內麥角固醇含量的測定結果Fig.6 Determination results of ergosterol contents in the cells of strain BY4741 and BY4741-ΔICT1under different NaCl contents

2.6 菌株BY4741和BY4741-ΔICT1細胞膜完整性的測定

出發(fā)菌BY4741和重組菌BY4741-ΔICT1經1.0 mol/L NaCl的YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細胞膜的受損情況見圖7。

圖7 1 mol/L NaCl條件下菌株BY4741（A）和BY4741-ΔICT1（B）細胞膜的受損情況Fig.7 Damage of cell membrane of strain BY4741(A)and BY4741-ΔICT1(B)under 1 mol/L NaCl

由圖7可知，經1.0mol/LNaCl處理后，出發(fā)菌BY4741幾乎未被染成紅色，細胞膜受損程度很低，而重組菌BY4741-ΔICT1被染成紅色，細胞膜受損程度嚴重。由此可見，ICT1基因的敲除確實在一定程度上影響了細胞膜的完整性，進而影響了酵母的耐鹽性。

2.7 菌株BY4741和BY4741-ΔICT1細胞膜上轉運蛋白基因的轉錄水平

研究發(fā)現，與出發(fā)菌BY4741相比，重組菌BY4741-ΔICT1對NaCl比較敏感，細胞膜受損嚴重，為研究ICT1基因的敲除是否對存在于細胞膜上的一些轉運蛋白有影響，因此，采用RT-QPCR技術對與細胞膜上離子轉運蛋白相關的兩個基因ENA1和NHA1進行基因轉錄水平測定，結果見圖8。

圖8 菌株BY4741和BY4741-ΔICT1細胞膜上離子轉運蛋白基因的轉錄水平Fig.8 Transcriptional levels of ion transporter gene on the cell membrane of strain BY4741 and BY4741-ΔICT1

由圖8可知，經1.0mol/LNaCl處理后，與出發(fā)菌BY4741相比，重組菌BY4741-ΔICT1細胞膜上的離子轉運蛋白基因的轉錄水平明顯下降，NHA1和ENA1基因的轉錄水平分別下降65.6%、90.5%，由此推測，ICT1的缺失影響了酵母轉運蛋白在高鹽應激時的轉錄水平，降低了有毒陽離子向胞外運輸的速率，從而使得其鹽耐受性下降。

3 結論

本研究以釀酒酵母BY4741為出發(fā)菌，利用同源重組技術敲除出發(fā)菌的ICT1基因，成功獲得了ICT1基因缺失菌株，命名為BY4741-ΔICT1。與出發(fā)菌BY4741相比，重組菌BY4741-ΔICT1對NaCl的耐受性減弱；經1.0 mol/L NaCl處理后，麥角固醇含量下降66.9%，細胞膜嚴重受損，細胞膜上存在的兩個轉運蛋白基因NHA1和ENA1轉錄水平分別下降65.6%和90.5%。說明ICT1基因的敲除，使得釀酒酵母鹽耐受性下降，可能與胞內麥角固醇合成減少、膜受損、離子轉運蛋白基因的轉錄水平下降有關，ICT1的缺失在影響膜成分的同時影響了離子轉運蛋白相關基因的表達。

本研究明確了ICT1基因缺失破壞了酵母生物膜的完整性，降低了酵母細胞的耐鹽性，但其具體機制尚不清楚，有待于進一步研究。本研究可為后續(xù)酵母耐鹽機理的解析提供一定的理論基礎，并對濃醪發(fā)酵工業(yè)生產菌株性狀的改造具有重要意義。